槐定碱对小鼠巨噬细胞TLR4及JNK/c-jun mRNA表达的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞表达TLR4、JNK和c-jun mRNA及分泌TNF-α的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW 264.7巨噬细胞,实验分为4组:空白对照组、槐定碱对照组、LPS组、槐定碱预处理组,用RT-PCR技术检测RAW 264.7细胞TLR4、JNK和c-jun的mR-NA表达量,放免法检测细胞培养液TNF-α分泌量。结果槐定碱对RAW 264.7巨噬细胞TLR4、JNK、c-jun的mRNA及细胞培养液中TNF-α基础表达无影响,但对经LPS激活的巨噬细胞的TLR4、JNK mRNA表达有显著抑制作用(均P<0.01),c-jun mRNA表达亦降低,但与LPS模型组比较差异尚无统计学意义。槐定碱预处理组细胞液中TNF-α含量显著低于LPS模型组(P<0.01)。结论槐定碱抗内毒素机制与其抑制LPS引起的TLR4、JNK的mRNA高表达,并减少TNF-α分泌有关。

白藜芦醇介导Tenascin-c/TLR4信号通路对类风湿性关节炎大鼠炎症的调控

目的:探讨白藜芦醇对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠炎症损伤的保护作用及其对Tenascin-c/TLR4信号通路的影响。方法:选择48只雄性SD大鼠,分为对照组,模型组,雷公藤多苷(20 mg/kg)组,白藜芦醇低、中、高剂量(15、30、60 mg/kg)组,每组8只,连续灌胃给药42天。除对照组外,剩余组大鼠在实验第1、14天2次在大鼠背部、尾根部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂,制备胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型。记录治疗期间各组大鼠体质量、关节肿胀及多发关节炎指数(arthritis indexes,AI)的变化,分析血清炎性因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平,检测滑膜组织Tenascin-c及TLR4蛋白表达情况。结果:与对照组比较,模型组大鼠体质量增长迟缓,后肢关节严重肿胀,AI值显著增高,血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显升高,且Tenascin-c及TLR4蛋白表达量也显著升高(P<0.05);与模型组大鼠比较,各药物干预组能够改善模型大鼠体质量、降低关节肿胀率及AI值(P<0.05),可显著抑制炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的产生(P <0.05),还能明显抑制炎性通路蛋白Tenascin-c和TLR4表达(P <0.05)。结论:白藜芦醇可通过抑制Tenascin-c/TLR4信号通路活化保护类风湿关节炎大鼠的炎症损伤。

槐定碱2种加药方式对LPS激活的RAW264.7巨噬细胞TLR4-JNK通路的影响

目的:观察槐定碱预处理和预混合2种给药方式对脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)及下游c-jun氨基末端激酶(JNK)、c-jun表达的影响,探讨槐定碱抗LPS的分子机制。方法:将RAW264.7细胞分为5组:RAW264.7细胞对照组加入未加血清的DMEM培养基;LPS组加含100μg/L LPS的DMEM培养基;槐定碱药物组加含31.25 mg/L槐定碱的DMEM培养基;槐定碱预处理组以含31.25 mg/L槐定碱的DMEM培养基孵育细胞24 h弃去槐定碱,而后加入100μg/L LPS的DMEM培养基继续孵育细胞;槐定碱预混合组以终浓度为31.25 mg/L槐定碱与100μg/L LPS预先混合1 h的DMEM培养基孵育细胞。上述5组处理完毕后于5、30、60、120 min收集细胞,以RT-PCR技术检测RAW264.7细胞TLR4、JNK、c-jun mRNA表达,免疫细胞化学和Western blot检测细胞c-jun的蛋白的表达。结果:RAW264.7细胞对照组与槐定碱药物组各项指标差异无统计学意义(P>0.05);LPS组RAW264.7细胞的TLR4、JNK、c-jun mRNA及c-jun蛋白表达均显著高于RAW264.7细胞对照组(P<0.01或P<0.05),但各指标显著升高的时间点有所不同;槐定碱预处理组与槐定碱预混合组RAW264.7细胞TLR4、JNK、c-jun mRNA及c-jun蛋白表达均显著低于LPS组(P<0.01或P<0.05),但各指标显著降低的时间点有所不同。结论:槐定碱可通过调控TLR4-JNK信号转导通路发挥抗LPS作用,其不同加药方式显示的效应表明其作用可能是多环节的。

VEGF-C/VEGFR3通路对肿瘤患者外周血来源DC的影响

目的:通过体外培养肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)来源的DC,探讨VEGF-C/VEGFR3信号通路对DC功能的影响。方法:采用GM-CSF和IL-4共同诱导的方法培养DC,分别采用VEGF-C(VEGF-C-DC),LPS(LPS-DC)或LPS+VEGF-C(LPS+VEGF-C-DC)诱导,同时设未处理组即未成熟DC细胞(imDC);流式细胞术检测DC表面CD80、CD83、VEGFR3和TLR4的表达情况,同时采用免疫荧光法检测VEGFR3在DC的表达;ELISA方法检测不同处理组的DC上清中IL-6、TNF-α、IL-12的分泌情况。结果:LPS-DC高表达VEGFR3;LPS-DC和LPS+VEGF-C-DC高表达CD80和CD83,明显高于imDC(18.56%vs 8.52%,P<0.05),显示出成熟DC的表型特征;与LPS-DC相比,LPS+VEGFC-DC表面TLR4的表达下调,LPS+VEGF-C-DC上清液中细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12的分泌减少。结论:VEGF-C/VEGFR3通路通过降低DC表面TLR4的表达减少其细胞因子的分泌,对DC起负向免疫调控作用。

益生菌对动脉粥样硬化患者血清TLR4及LDL-C的影响

目的 :探讨益生菌对动脉粥样硬化患者血清低密度脂蛋白及Toll样受体4的影响。方法 :选取湖南师范大学第二附属医院2018年05月~11月心血管内科及老年病科新入院,并首次诊断有AS斑块的患者65例,随机分为阿托伐他汀组(AT组)、益生菌组(PT组)及阿托伐他汀加益生菌组(APT组)。详细记录所有研究对象基线谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、LDL-C及TLR4浓度,并记录颈总动脉内膜中层厚度(IMT)及斑块面积。在予以健康生活方式指导的基础上(低盐低脂饮食、戒烟戒酒、适当运动等),AT组予以口服阿托伐他汀钙分散片(20 mg,每天1次);PT组予以口服双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(2.0 g,每天3次);APT组同时使用上述两种药物。治疗8周后,次日清晨空腹状态下再次抽取肘静脉血复测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、TLR4及LDL-C浓度,并再次复查IMT及斑块面积。所有数据收集完毕后进行数据统计和分析。结果 :治疗后三组研究对象血清LDL-C及TLR4浓度分别进行组间比较,三组间差异均有统计学意义;治疗前后三组研究对象血清LDL-C、TLR4浓度进行组内比较,差异均具有统计学意义,其中APT组治疗前后均下降最明显,AT组比PT组血清LDL-C浓度下降明显,PT组比AT组血清TLR4浓度下降明显。治疗前后三组研究对象IMT及斑块面积进行组内比较,差异均无统计学意义。治疗前、治疗后三组研究对象LDL-C、TLR4与IMT及斑块面积均呈正相关,差异均有统计学意义。结论 :益生菌可降低颈AS斑块患者血清TLR4和LDL-C水平。

MOTS-c通过TLR4对肠源性脓毒症的作用及其机制

目的:脓毒症是机体对感染产生的全身性炎症反应综合征,由于具体机制尚不明确,临床治疗效果不佳,死亡率一直居高不下。本实验通过研究线粒体来源多肽MOTS-c通过影响Toll样受体4在肠源性脓毒症小鼠模型中的作用及其相关机制,寻找新的临床治疗靶标,为感染性疾病的研究开拓新的思路。方法:在盲肠结扎穿孔(CLP)所致肠源性脓毒症小鼠给予MOTS-c处理后检测小肠组织中检测炎症相关因子TNF-α,IL-6,IL-1β水平,检测TLR4表达水平,并且在野生型和TLR4过表达小鼠中构建CLP模型并给予MOTS-c处理,将其与对照组进行比较,以明确TLR4在MOTS-c对脓毒症影响中的作用。结果:在MOTS-c组CLP小鼠模型中,小鼠体内促炎因子TNF-α,IL-6,IL-1β水平与对照组相比显著降低(P<0.05),此外,TLR4与对照组相比表达下降,进一步在TLR4过表达小鼠CLP模型中对小鼠给予MOTS-c处理发现,MOTS-c对小鼠CLP的抗炎作用被抑制,小鼠体内促炎性因子TNF-α,IL-6,IL-1β水平与野生型小鼠比较均显著上升,差异具有统计学意义,说明过表达TLR4逆转了MOTS-c的抗炎作用,提示MOTS-c可以在肠源性脓毒症中发挥抗炎作用,并且此过程可能依赖于TLR4。结论:MOTS-c可以在脓毒症中抑制小肠上皮细胞中TLR4过度激活,最终抑制炎症,因此可能对脓毒症有治疗效果,有望用于临床治疗。

黄芪汤基于miR-93和miR-140-5p介导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对^(12)C^(6+)辐射下丘脑损伤的防护机制

目的:观察黄芪汤对^(12)C^(6+)辐射脑损伤大鼠下丘脑组织中miRNA的基因表达及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响,初步探讨黄芪汤对重离子辐射损伤的防护机制。方法:SPF级Wistar大鼠50只随机分为正常对照组,辐射模型组,黄芪汤高、中、低剂量组(18、9、4.5 g·kg^(-1)·d^(-1)),灌胃2周。干预7 d后除正常对照组外,其余各组脑组织给予4 Gy^(12)C^(6+)离子束单次照射,辐射后7 d处死各组大鼠。HE染色观察垂体组织的病理形态学改变;ELISA检测下丘脑组织IL-1β、IL-6的分泌情况;RT-PCR法检测下丘脑中miRNA与TLR4的基因表达;Western blot法检测下丘脑中TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达。结果:与辐射模型组比较,黄芪汤高剂量组IL-1β水平显著降低(P<0.01),中、高剂量组IL-6水平及miR-93、TLR4的基因表达显著降低(P<0.01),miR-140-5p的基因表达显著增加(P<0.01),黄芪汤各剂量组中TLR4、MyD88、NF-κB p65以及p-NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.01),黄芪汤高剂量组核固缩、深染现象明显减轻,偶见凋亡小体。Pearson分析表明,下丘脑中miR-93与TLR4蛋白、mRNA表达水平具有显著正线性相关性(P<0.01),而miR-140-5p与TLR4蛋白和mRNA表达水平呈现负线性相关性(P<0.01)。结论:黄芪汤可能是通过抑制miR-93的过度表达和促进miR-140-5p的表达抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活,从而抑制其下游的炎症级联反应,减轻重离子辐射后造成的下丘脑损伤,发挥抗辐射的作用。

当归芍药散对非酒精性脂肪肝大鼠TLR4/MyD88/JNK信号通路的影响

目的:探讨当归芍药散对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠的治疗作用及其机制。方法:60只清洁级SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、易善复组(0.144 g·kg^(-1))及当归芍药散低、中、高剂量组(2.44,4.88,9.76 g·kg^(-1))。通过喂饲高脂饲料复制NAFLD大鼠模型,造模同时给予相应药物治疗,8周后,采集血清和肝组织标本,检测血清中胆固醇(TC),甘油三酯(TG),丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL^(-1)0)的含量或活性变化及肝脏TC,TG,游离脂肪酸(FFA)的含量变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏中Toll样受体4(TLR4),髓样分化因子88(MyD88),c-Jun氨基末端激酶(JNK)的基因和蛋白表达及l磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达情况;苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色观察肝脏病理形态学变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清中TC,TG,ALT,AST,TNF-α以及肝组织中TC,TG,FFA的含量或活性、肝脏中TLR4,MyD88和JNK的mRNA和蛋白表达及p-JNK的蛋白表达水平显著升高(P<0.01),IL^(-1)0的含量均显著降低(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散各剂量组大鼠血清中TC,TG,ALT,AST,TNF-α和肝组织中TC,TG,FFA的含量或活性、肝脏中TLR4,MyD88,JNK的mRNA和蛋白表达及p-JNK的蛋白表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),IL^(-1)0的含量均明显升高(P<0.05,P<0.01),HE染色和油红O染色结果提示其能明显减轻肝脏脂肪变性程度。结论:当归芍药散可能通过抑制TLR4/MyD88/JNK信号通路,减轻炎症反应来治疗NAFLD。

微生物多糖调控克罗恩病肠道炎症免疫反应的机制研究

目的:研究微生物多糖调控克罗恩病肠道炎症免疫反应的机制。方法:选取60只健康雄性BABL/c小鼠,将小鼠随机分为三组,分别为对照组、模型组及实验组,每组20只。实验组和模型组小鼠建立克罗恩病模型,实验组小鼠给予灌胃已制备好的微生物多糖溶液0.25 mL/次,模型组和对照组小鼠灌胃等量的无菌水,2次/d,连续21 d。检测各组小鼠疾病活动度评分、组织病理学评分及相关通路蛋白。结果:与对照组相比,模型组和实验组小鼠DAI评分明显升高;与模型组相比,实验组小鼠DAI评分明显降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组及实验组小鼠组织病理学评分明显升高;与模型组相比,实验组小鼠组织病理学评分显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和实验组血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平升高,IL-10表达水平降低;与模型组相比,实验组血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平降低,IL-10表达水平升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组和实验组小鼠结肠组织炎性因子Toll-样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白抗原88(MyD88)、核因子кB p65(NF-κBp65)蛋白表达水平均明显升高;与模型组相比,实验组小鼠结肠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论:微生物多糖通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控克罗恩病肠道炎症免疫反应的机制。

苦参碱减轻N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导的大鼠胃黏膜损伤及机制

目的研究苦参碱对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导大鼠胃黏膜损伤的影响及机制。方法将75只Wister大鼠随机分为空白组、模型组、(100、150、200)mg/kg苦参碱处理组。除空白组外,其余各组采用MNNG复合造模方法建立胃黏膜损伤大鼠模型。造模成功后,苦参碱处理组大鼠分别腹腔注射(100、150、200)mg/kg苦参碱,连续给予45 d。最后一次给药后,测定各组实验大鼠的体质量、24 h饮食饮水量。处死大鼠后收集组织样本,ELISA测定胃黏膜组织白细胞介素1β(IL-1β)、IL-4、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;HE染色观察胃黏膜组织的病变情况,免疫组织化学染色检测胃黏膜组织血管内皮生长因子C(VEGF-C)和血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)的表达,Western blot法检测各组大鼠胃组织Bcl2、BAX、胱天蛋白酶3(caspase-3)、细胞色素C(Cyt-C)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)和核因子κB p65(NF-κBp65)的蛋白水平。结果苦参碱处理的胃黏膜损伤大鼠的饮食饮水量、体质量增加,胃黏膜组织的损伤减轻;苦参碱能够显著降低胃黏膜组织VEGF-C和VEGFR3表达,增加Bcl2蛋白水平并降低BAX、caspase-3、Cyt-C、TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白水平。结论苦参碱能够减轻MNNG引起的大鼠胃黏膜损伤,可能与其抑制VEGF-C/VEGFR3和NF-κB/TLR4信号通路有关。

拮抗Toll样受体4的表达对内毒素血症小鼠肾脏损伤的保护作用

目的观察拮抗Toll样受体4(TLR4)的表达对内毒素血症小鼠肾脏损伤的保护作用以及对细胞核因子-κB(NF-κB)p65的影响。方法采用内毒素(LPS)诱导的小鼠急性肾功能衰竭模型,并应用TLR4单克隆抗体进行干预,观察TLR4单克隆抗体对内毒素血症小鼠的肾脏组织学、血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平以及肾组织中TLR4及NF-κB水平的影响。结果与模型组比较,TLR4单克隆抗体能够明显改善内毒素血症小鼠肾脏组织病理学损害;降低血清中Cr、BUN、胱抑素C、IL-1β和IL-6水平(t=7.20、7.86、9.99、8.79、3.92,P均<0.05),并且降低肾组织中TLR4及NF-κB p65水平(t=20.94、11.21,P均<0.05)。结论 TLR4单克隆抗体能够保护内毒素血症小鼠肾脏组织损伤,其作用机制可能与调节TLR4/NF-κB信号转导通路有关。

尿感方抗尿道致病性大肠杆菌侵袭膀胱上皮细胞的作用研究

目的观察尿感方抗尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escheriehia coli,UPEC)侵袭膀胱上皮细胞的作用,并探讨其作用机制。方法通过UPEC感染人膀胱癌细胞5637(human bladder cancer cell 5637,HTB-9)侵袭模型,观察尿感方含药尿液保护膀胱上皮细胞抗UPEC侵袭的作用;同时采用分子生物学技术,观察其对Toll样受体4(TLR4)/环磷酸腺苷(c AMP)信号传导通路的主要环节:TLR4、腺苷酸环化酶3(AC3)、环磷酸腺苷(c AMP)、蛋白激酶A(PKA)和Rac-1的影响。结果与大鼠空白尿液高剂量组(体积分数10%空白尿液)比较,尿感方大鼠含药尿液高剂量组(体积分数10%含药尿液)的细菌入侵率降低;与模型组比较,大鼠空白尿液组的细菌入侵率无显著性差异。与大鼠空白尿液高剂量组比较,尿感方大鼠含药尿液高剂量组增加了TLR4、AC3蛋白的表达及胞内c AMP的水平,促进了PKA活化,抑制了Rac-1的活性。结论尿感方具有一定的抗UPEC侵袭膀胱上皮细胞的作用,其作用机制与影响TLR4/c AMP信号传导通路的环节有关。