益肾通癃汤通过上调miR-145-5p抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路抗前列腺癌作用机制研究

目的探讨益肾通癃汤(YSTLD)通过上调miR-145-5p抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路抗前列腺癌的作用机制。方法借助miRNA芯片技术检测YSTLD处理前列腺癌PC-3细胞后的miRNA表达谱的变化,筛选miRNA芯片结果中差异显著的miRNA,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)进行验证。慢病毒转染miR-145-5p入前列腺癌PC-3细胞,CCK8法及划痕实验检测miR-145-5p对前列腺癌PC-3细胞增殖与迁移作用;qRT-PCR法及Wstern blot法检测miR-145-5p对TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路及凋亡相关基因caspase3、TNF-α、Bax、Bcl-2表达的影响;qRT-PCR及Wstern blot法检测YSTLD含药血清对miR-145-5p、TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路及凋亡相关基因caspase3、TNF-α、Bax、Bcl-2表达的影响。结果miRNA基因芯片检测发现YSTLD处理前列腺癌PC-3细胞后存在35种miRNA表达水平与对照组存在显著差异,其中以miR-145-5p差异最为显著,同时qRT-PCR验证发现YSTLD处理的PC-3细胞中的miR-145-5p水平显著高于DMSO对照组(P<0.05)。慢病毒转染miR-145-5p入前列腺癌PC-3细胞后,发现miR-145-5p能抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移。过表达miR-145-5p可上调前列腺癌PC-3细胞caspase3、TNF-α及Bax mRNA表达水平,下调p38 MAPK、p65 NF-κB及Bcl-2的mRNA表达水平(P<0.05),同时上调前列腺癌PC-3细胞caspase3蛋白表达水平,下调TLR4、p38 MAPK、p65 NF-κB的蛋白表达水平(P<0.05);YSTLD含药血清在干预前列腺癌PC-3细胞后,可上调前列腺癌PC-3细胞caspase3、TNF-α及Bax mRNA表达水平,下调p38 MAPK、p65 NF-κB、Bcl-2、TRAF1的mRNA表达水平(P<0.05),同时上调前列腺癌PC-3细胞caspase3蛋白表达水平,下调TLR4、p38 MARK、p65 NF-κB、TRAF1的蛋白表达水平(P<0.05)。结论YSTLD可通过上调miR-145-5p的表达水平,抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路促进前列腺癌PC-3细胞凋亡,这可能是YSTLD抗前列腺癌的重要机制。

疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路的影响

目的探讨疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路的干预作用,从炎症角度揭示疏肝健脾方药抗大鼠NASH的作用机制。方法选用SPF级SD大鼠120只,随机分为8组。采用高脂饲料喂养建立大鼠NASH模型,26 w后对肝组织进行HE染色,油红O染色,全自动生化分析肝功血脂改变,ELISA检测血清白介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量;采用离体循环灌注Ⅳ型胶原酶法分离肝细胞,流式细胞术(FCM)对肝细胞纯度进行活性和纯度鉴定。荧光定量PCR检测肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA表达量;Western印迹法检测肝细胞蛋白TLR4、p38MAPK及磷酸化蛋白p38MAPK表达水平。结果 26 w高脂饮食成功建立了NASH大鼠模型,HE染色和油红O染色证实大鼠模型存在典型的NASH病理改变。与正常组比较,模型组血清IL-1、IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.01);各用药组与模型组比较,合方高、低剂量组IL-1、IL-6、TNF-α含量显著降低(P<0.05,P<0.01),健脾高剂量组IL-1、IL-6含量降低有统计学差异(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠肝细胞TLR4、p38MAPK mRNA表达及磷酸化蛋白p38MAPK表达量显著增加(P<0.01);各用药组与模型组比较,合方高、低剂量组,健脾高剂量组TLR4、p38MAPK mRNA蛋白及磷酸化蛋白p38MAPK表达量显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论疏肝健脾方药能够降低NASH大鼠血清炎症因子水平,改善NASH大鼠肝脏的病理变化,TLR4/p38MAPK可能是疏肝健脾方药发挥抗NASH作用的药物靶点。

槐果碱对SNI致神经病理性疼痛小鼠脊髓组织TLR4/p38 MAPK的影响

目的观察槐果碱(sohpocarpine,SC)对坐骨神经分支保留性损伤(spared nerve injury,SNI)致小鼠神经病理性疼痛的缓解作用,并探讨其部分作用机制。方法将60只♂ICR小鼠随机分为6组,分别为:假手术组(control)、神经病理性疼痛模型组(model)、普瑞巴林阳性对照组(SNI+普瑞巴林10 mg·kg^(-1))、槐果碱高、中、低剂量组(SNI+sophocarpine 40、20、10 mg·kg^(-1))。采用SNI法建立小鼠神经病理性疼痛动物模型,于术前1 d、术后d 7(给药前d 1)及给药后1、3、5、7 d测定小鼠机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)、热刺激缩足反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)及冷缩足反射次数(cold withdrawal times,CWT);采用RT-PCR和Western blot法检测槐果碱对SNI损伤小鼠脊髓组织TLR4、p38 MAPK、IL^(-1)β、TNF-αm RNA及蛋白表达的影响。结果与假手术组比较,SNI致神经病理性疼痛模型组小鼠术后PWMT明显降低、PWTL明显缩短、CWT明显增多;小鼠脊髓组织p38 MAPK、TLR4、TNF-α、IL^(-1)βm RNA和蛋白表达水平明显上调。与模型组小鼠比较,SNI+槐果碱40 mg·kg^(-1)组小鼠给药后PWMT明显升高、PWTL延长、CWT减少;小鼠脊髓组织p38MAPK、TLR4、TNF-α、IL^(-1)βm RNA和蛋白表达水平明显下调。结论槐果碱对SNI致神经病理性疼痛有较好的缓解作用,其机制可能与其下调TLR4、p38 MAPK、IL^(-1)β及TNF-α表达水平有关。

FGF21对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK通路的影响

目的探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)对谷氨酸钠(MSG)诱导非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞炎症及TLR4/p38MAPK信号通路的影响。方法新生SD大鼠随机分成正常对照组、MSG组和FGF21组(n=10)。MSG组和FGF21组大鼠于生后第2、4、6、8、10天皮下注射MSG 4g/(kg·d)喂养至13周,FGF21组大鼠腹腔注射FGF21 1mg/(kg·d)32天。HE染色分析肝脏病理学改变;观察肝重、肝功能;qRT-PCR和Western blot法检测肝组织IL-6、TNF-α、TLR4、p38MAPK表达情况。结果与正常对照组比较,MSG组大鼠肝细胞发生脂肪变性伴炎性细胞浸润,肝重、ALT、AST、ALP水平升高(P<0.01),肝细胞IL-6、TNF-α、TLR4、p38MAPK mRNA表达增加(P<0.01),TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达升高(P<0.01);与MSG组比较,FGF21组大鼠肝细胞脂泡和炎性细胞减少,肝重、ALT、AST、ALP降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05),IL-6、TNF-α、TLR4、p38MAPK mRNA表达下降(P<0.01),TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平降低(P<0.01)。结论 FGF21可能通过调节TLR4/p38MAPK信号转导通路,抑制NAFLD炎性反应。

乳房炎奶牛乳腺组织中TLR4/p38的表达差异分析

[目的]本文旨在探究p38通路及相关因子与乳房炎的关系。[方法]选择正常和患临床乳房炎2组共6头荷斯坦奶牛进行研究。收集2组奶牛的乳样、血样以及组织样品,利用石蜡包埋和HE切片染色对奶牛乳腺组织进行观察,通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对p38、TLR4、TNF-α和IL-1βmRNA水平的表达进行分析,通过ELISA和Western blot对p38、TLR4、TNF-α和IL-1β蛋白水平的差异表达进行分析。[结果]患乳房炎奶牛乳腺组织中p38、IL-1β和TNF-αmRNA水平表达显著升高(P<0.05)。ELISA结果表明:两组样品中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平差异显著(P<0.05)。组织Western blot结果显示,临床乳房炎奶牛的组织中TLR4、p38以及磷酸化p38(p-p38)的表达量与对照组相比差异显著(P<0.05)。[结论]p38信号通路相关蛋白在发生临床性乳房炎的奶牛乳腺组织中的表达量与正常奶牛的表达量差异显著,提示了p38通路在乳房炎的发病过程中可能起着重要的作用。

小檗碱调控TLR4/p38MAPK通路促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复

目的 观察小檗碱对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用并探索其作用机制。方法 SD大鼠45只,随机分为假手术组(sham)、模型组(MCAO/R)、小檗碱治疗组(Ber)。通过线栓法建立脑缺血再灌注模型。Ber组给药剂量为140 mg/kg。给药28 d后应用Zea-longa评分和旋转棒实验评估大鼠神经功能。给药24 h后通过TTC染色观察并统计梗死面积。给药24 h后取材大鼠脑组织,应用免疫荧光染色观察白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)的表达,应用免疫酶联吸附实验(enzyme linked immunosorbent assa, ELISA)检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、和白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)的含量,通过Western Blot方法检测各组脑组织中TLR4、P-p38MAPK、p38MAPK蛋白含量。结果 Zea-longa评分和旋转棒实验结果证明小檗碱显著改善脑缺血再灌注损伤大鼠的运动能力。TTC染色结果表明小檗碱减少梗死面积。免疫荧光染色和ELISA实验结果证实小檗碱能够减少缺血损伤脑组织中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量,增加抗炎因子IL-10的含量。Western Blot结果提示小檗碱影响TLR4/p38MAPK通路蛋白的表达。结论 小檗碱通过TLR4/p38MAPK信号通路抑制MCAO/R大鼠脑组织中炎症因子的分泌,促进缺血再灌注大鼠神经功能恢复。

疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤及TLR4/p38MAPK信号通路影响的研究

目的： 研究疏肝健脾方药含药血清对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下大鼠肝细胞炎症反应及TLR4（Toll样受体-4）/p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信号通路的影响。 方法： 体外培养并鉴定SD大鼠肝细胞，制备疏肝健脾方药含药血清，对肝细胞进行疏肝健脾方药、p38MAPK抑制剂等药物干预，酶联免疫法（ELISA）检测细胞上清液中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的表达，Western blot检测 TLR4，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白的表达。 结果： 可提取大鼠疏肝健脾方药含药或空白血清约2～3 mL，大鼠获得纯化后肝细胞1.5×10^8～2.0×10^8个，Typan blue染色测定细胞活力均在95%以上，免疫荧光法鉴定确定提取的为肝细胞。肝细胞培养上清的检测： LPS组较空白血清组IL-6，TNF-α水平均有显著升高（P〈0.01）。与LPS组比较，药物干预组IL-6，TNF-α表达水平呈显著降低（P〈0.01）。肝细胞的蛋白检测：与空白血清组比较，LPS组的p38MAPK，p-p38MAPK，TLR4蛋白表达均有显著升高（P〈0.01）；与LPS组比较，SB239063能显著下调p38MAPK的蛋白表达水平（P〈0.01），疏肝健脾组亦有下调，但无显著差异；疏肝健脾组，SB239063组的p-p38MAPK的蛋白表达水平均下调显著（P〈0.01）；TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调具有显著性差异（P〈0.01），SB239063组下调无显著统计学差异。 结论： 疏肝健脾方药可能通过TLR4/p38MAPK信号通路调控大鼠肝细胞炎症损伤，含药血清可能是其重要的作用途径之一。

TLR_4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用及其机制,为神经退行性疾病(ND)的发病机制与防治研究提供新的实验依据。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实验1设正常对照组、LPS组及TLR4抗体+LPS组;免疫荧光法检测P-P38,P-JNK的表达。实验2分为6组:正常对照组,LPS组,TLR4抗体+LPS组,SB202190(抑制P38)+LPS组,SP600125(抑制JNK)+LPS组,PD98059(抑制ERK)+LPS组;分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后再给以LPS刺激24 h,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Active-caspase-3的表达变化;流式细胞术检测海马神经元凋亡率。结果:LPS组海马神经元P-P38、P-JNK的表达明显高于正常对照组(P<0.01),TLR4抗体+LPS组P-P38,P-JNK表达显著低于LPS组(P<0.01)。与正常对照组相比,LPS组海马神经元Bcl-2/Bax表达减少、Active-caspase-3表达增加,海马神经元凋亡率增加(P<0.01)。而TLR4抗体+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组Bcl-2/Bax显著高于LPS组、Active caspase-3显著低于LPS组(P<0.01),海马神经元凋亡率显著低于LPS组(P<0.05,P<0.01)。PD98059+LPS组与LPS组海马神经元凋亡率无明显差异。结论:1海马神经元中有TLR4介导的P38/JNK信号通路。2海马神经元TLR4激活后,P-P38、P-JNK表达增加,使Bcl-2/Bax的比例降低和Active-caspase-3表达增加,从而促进海马神经元的凋亡。海马神经元凋亡过程中有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与。

基于TLR4/p38MAPK/AP-1信号通路探讨心痛泰对兔动脉粥样硬化和血管重构的影响

目的:基于TLR4/p38MAPK/AP-1信号通路探讨心痛泰对兔动脉粥样硬化和血管重构的影响。方法:日本大耳白兔120只随机分为空白组,模型组,心痛泰低、中、高剂量组和瑞舒伐他汀组。采用前瞻性实验研究,造模的同时给予药物灌胃。8周后取胸主动脉,免疫组化法测定白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1);Masson染色观察胶原分解和平滑肌纤维;测定胸主动脉最大内膜厚度(MIT)、最小管腔直径(MLD)、管腔面积(LA)、内弹力膜围绕面积(IELa)、外弹力膜围绕面积(EELa),计算内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、管腔狭窄百分比(LS);Western Blot法测定胸主动脉组织Toll样受体-4(TLR4)、丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、转录激活因子(AP-1)的蛋白表达。结果:与模型组比较,心痛泰各剂量组、瑞舒伐他汀组IL-8、MCP-1、MMP-9含量显著降低(P<0.01),TIMP-1含量显著升高(P<0.05,P<0.01),TLR4、p38MAPK、AP-1的蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与心痛泰低剂量组比较,心痛泰高剂量组及瑞舒伐他汀组IL-8、MCP-1、MMP-9显著降低(P<0.01),TIMP-1升高(P<0.01),TLR4、p38MAPK、AP-1的蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,心痛泰各剂量组、瑞舒伐他汀组的IA、MA、LS均显著降低(P<0.01)。与心痛泰低剂量组比较,心痛泰中、高剂量组和瑞舒伐他汀组的IA、MA、LS均显著降低(P<0.01)。Masson染色显示,模型组管壁变薄,胶原分解增多,平滑肌纤维排列紊乱,管腔直径扩大,管腔内血栓形成;与模型组比较,心痛泰各剂量组和瑞舒伐他汀组动脉管壁胶原纤维分解减少,平滑肌细胞排列较为整齐,管腔、管壁结构有所改善。结论:心痛泰可能是通过调控TLR4/p38MAPK/AP-1信号通路及下游的细胞因子,减少血管胶原分解、抑制纤维细胞增生,改善动脉粥样硬化和血管重构。

TLR4/P38Mapks信号通路与糖尿病肾病相关性的研究进展

随着我国医疗水平的不断提高,我国在糖尿病与糖尿病肾病上的研究加深,对TLR4/P38Mapks信号通路与糖尿病肾病相关性的研究更进一步,笔者在前人探究结果的基础上,开展探究活动。糖尿病与糖尿病肾病患者的TLR4/P38Mapks表达都高于健康人群,因此TLR4/P38Mapks表达与糖尿病肾病患者的病情存在密切关系,且糖尿病与糖尿病肾病患者的TLR4/P38Mapks表达与尿蛋白排泄率、尿素氮之间存在正相关,而DN组TLR4/P38Mapks表达又与患者血清中的IL-6、IL-8之间也存在正相关关系。本文先是对MAPKs信号通路生化特征与糖尿病肾病的相关性进行概述,又详细阐述了糖尿病肾病与TLR4的相关性。

TLR4调控p38信号通路对呼吸道合胞病毒感染的支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡中的作用及机制。方法 RSV感染支气管上皮细胞16HBECs,以Real-time PCR测定TLR4 mRNA水平,以Western blot法测定TLR4蛋白表达。在细胞中转染TLR4 shRNA,用RSV感染后,流式细胞术测定凋亡,分光光度法检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性,Western blot检测p38磷酸化水平。用p38信号通路抑制剂处理敲低TLR4后的细胞,用RSV感染后,流式细胞术检测凋亡,分光光度法检测Caspase-3活性。结果 RSV处理后的16HBECs细胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均高于未经RSV处理的细胞(P <0. 05)。RSV感染后的细胞凋亡率升高,细胞中Caspase-3活性升高,细胞中p38磷酸化水平也升高,与未经RSV感染的细胞比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。转染TLR4 shRNA的细胞经RSV感染,细胞凋亡率降低,细胞中Caspase-3活性下降,细胞中p38磷酸化水平降低,与未做转染的细胞比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。p38信号通路抑制剂处理的敲低TLR4后的细胞凋亡率进一步降低,细胞中Caspase-3活性进一步下降,与未经p38信号通路抑制剂处理的细胞相比,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论敲低TLR4可以通过抑制p38信号通路的激活减少RSV诱导的支气管上皮细胞凋亡。

黄芪甲苷介导TLR4-p38 MAPK信号通路在幼鼠急性肺损伤中的研究

目的探究黄芪甲苷介导TLR4-p38 MAPK信号通路在幼鼠急性肺损伤模型中的作用。方法以7日龄SD新生仔鼠为实验对象,利用脂多糖构建幼鼠急性肺损伤模型,以地塞米松为阳性药对照,每只幼鼠腹腔注射10 m L/kg黄芪甲苷,造模后12 h和24 h观察肺组织病变,检测TLR4、p-p38蛋白和mRNA表达量,TNF-α、IL-6、IL-12炎症因子的mRNA表达量变化。结果模型组在建模后12 h呈现肺出血,大量肺泡萎陷,24 h呈现肺水肿,肺泡间隔明显增宽。和模型组相比,黄芪甲苷组肺组织的病变明显减轻。另外,蛋白检测结果表明,与模型组比较,黄芪甲苷组TLR4、p-p38蛋白表达量明显降低(P<0. 05,P<0. 001) q-PCR结果表明,与模型组比较,黄芪甲苷组TLR4 mRNA相对表达量均有明显的降低,并且和模型组有显著性差异(P<0. 05)。TNF-α、IL-6、IL-12各炎症因子均有下降的趋势,其中IL-12相对表达量和模型组有显著性差异(P<0. 05)。结论黄芪甲苷通过抑制TLR4-p38MAPK信号通路,在幼鼠急性肺损伤模型中起重要作用。

木丹颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠TLR4相关通路的调控作用研究

目的:探讨木丹颗粒对糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)大鼠坐骨神经Toll样受体4(toll-like receptor-4,TLR4)蛋白相关通路的调控作用。方法:将SD雄性大鼠随机分为空白对照组和高糖组,高糖组制备糖尿病模型,并分为模型组,α-硫辛酸组和木丹颗粒组,给予相应药物干预12周后,收集大鼠腹主动脉血制备血清,采用酶联免疫吸附剂法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)含量,收集坐骨神经用于RT-PCR法、免疫荧光化学法和Western blot法测定Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)的mRNA和蛋白表达,电镜下观察大鼠主骨神经髓鞘结构形态。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠神经传导速度(nerve conduction velocity,NCV)显著降低(P<0.05),鼠尾热痛阈值(thermal pain threshold,TPT)显著升高(P<0.05),坐骨神经出现脱髓鞘现象;血清中炎症因子TNF-α和IL-6含量显著升高(P<0.05),坐骨神经中TLR4、MyD88、NF-κB和p38 MAPK的mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,木丹颗粒组大鼠NCV显著升高(P<0.05),TPT显著降低(P<0.05);脱髓鞘现象显著改善;血清中炎症因子TNF-α和IL-6含量显著降低(P<0.05),坐骨神经中TLR4、MyD88、NF-κB和p38 MAPK的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论:木丹颗粒能够通过调控TLR4/MyD88/NF-κB通路和TLR4/p38 MAPK通路改善炎症反应,改善周围神经功能的损伤,从而防治DPN。

基于TLR4/MyD88/NF-κB与p38 MAPK信号通路研究麻杏石甘汤减轻咳嗽变异性哮喘大鼠炎症反应的作用及机制

探讨麻杏石甘汤对咳嗽变异性哮喘(CVA)大鼠炎症反应的作用及机制。6~8周龄SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、孟鲁司特钠组以及麻杏石甘汤低、中、高剂量组,每组8只;采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)_(3)]致敏并用OVA激发的方法复制大鼠CVA模型,正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,各受试药组给予相应药物灌胃。实验结束后,检测各组大鼠血液白细胞计数,血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;蛋白免疫印迹法检测肺组织中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和磷酸化核转录因子-κB p65(p-p65)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)水平,实时荧光定量分析法检测肺组织中TLR4、MyD88 mRNA表达水平。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠具有明显哮喘表型,血液白细胞计数和IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01),IL-10水平显著降低(P<0.01),气道周围炎症细胞浸润明显,细胞排列紊乱,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平以及TLR4、MyD88 mRNA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,孟鲁司特钠组、麻杏石甘汤高剂量组白细胞计数和IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01),气道炎症细胞浸润、细胞排列紊乱程度明显减轻,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平以及TLR4、MyD88 mRNA水平显著降低(P<0.01)。与孟鲁司特钠组比较,麻杏石甘汤高剂量组大鼠血液白细胞数,血清中IL-10和TNF-α含量,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平及TLR4、MyD88 mRNA水平,均无显著差异。麻杏石甘汤具有抑制CVA大鼠气道炎症反应的作用,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB以及p38 MAPK信号通路的激活相关。

MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞释放炎性细胞因子

目的探讨MRP8/MRP14诱导小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子表达效应及其作用机制。方法 Luminex x MAP液相芯片系统检测重组MRP8/MRP14蛋白诱导腹腔巨噬细胞6种细胞因子/趋化因子的水平变化;MRP14不同结构域融合蛋白刺激细胞,检测TNF-α、IP-10和IL-6表达;Western blot检测MRP8/MRP14刺激细胞p38 MAPK、JNK和ERK激酶磷酸化变化;细胞预先用p38 MAPKs、JNK、ERK激酶抑制剂、TLR4和RAGE受体拮抗剂预处理,之后给予MRP8/MRP14蛋白刺激,检测TNF-α、IP-10和IL-6表达。结果 MRP8/MRP14能显著诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达,与对照组相比,蛋白表达水平分别升高约98.2、378.6和6.3倍(P<0.01),MRP8/MRP14不能诱导IL-2、IL-5和IFN-g的表达;MRP14全长及其结构域EFhand-1、EFhand-2及EFhand-1+2融合蛋白能够诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.01),CT末端结构域不具有诱导活性;MRP8/MRP14刺激细胞后1 h p38 MAPK、JNK及ERK激酶发生显著磷酸化变化,持续至2 h;与单纯MRP8/MRP14组相比,p38 MAPK抑制剂SB203580显著抑制TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.05);JNK抑制剂SP600125显著抑制TNF-α和IP-10的表达(P<0.05),对IL-6的表达无影响;ERK及其上游MEK1/2的抑制剂PD98059和U0126显著抑制IL-6的表达(P<0.05);TLR4抑制剂TAK242抑制了MRP8/MRP14诱导的TNF-α、IP-10和IL-6的表达(P<0.05),而RAGE中和性抗体仅部分抑制MRP8/MRP14诱导的IL-6的表达(P<0.05)。结论 MRP8/MRP14能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6的表达;MRP蛋白以包含有钙离子结合基序的结构域具有诱导细胞因子表达的活性;TNF-α和IP-10的表达与TLR4受体及其下游的p38 MAPKs、JNK通路有关,IL-6的表达则同时由TLR4和RAGE受体介导,继而激活下游的p38 MAPKs和ERK信号通路。

栀子苷对缺氧/复氧小胶质细胞TLR4通路的影响

目的研究缺氧/复氧对原代培养的小胶质细胞TLR4受体及其通路中MyD88、NF-κBp65、p-ERK1/2、p-IκBα和p38的影响和不同浓度栀子苷的干预作用,以揭示栀子苷治疗脑缺血的分子生物学机制。方法原代培养小胶质细胞,采用缺氧/复氧的方式制备模型,用栀子苷125、250和500μmol.L-1 3个浓度梯度进行干预,用逆转录聚合酶链反应检测小胶质细胞TLR4 mRNA的表达,Western blot检测TLR4、p-IκBα、p38、p-ERK1/2蛋白,免疫荧光双染观察MyD88和NF-κB;结果缺氧/复氧激活了TLR4通路,并通过MyD88依赖途径激活了下游蛋白MyD88、NF-κBp65、p-ERK1/2、p-IκBα和p38;栀子苷250和500μmol.L-1组抑制了通路蛋白的活性;结论缺氧/复氧使TLR4通路蛋白磷酸化激活。栀子苷通过对TLR4通路蛋白的抑制发挥抗炎效应,促进脑缺血的恢复。

大黄蛰虫胶囊对糖尿病大鼠视网膜炎症的抑制作用

目的探讨大黄蛰虫胶囊抑制糖尿病大鼠视网膜炎症的作用机制。方法随机选取10只大鼠作为空白组,其余50只均采用链佐脲菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,造模成功后随机分为模型组及大黄蛰虫胶囊低、中、高剂量组(0.17、0.34、0.68 g/kg),给予相应药物干预。第1个月每2周记录大鼠体质量及空腹血糖,随后每4周记录1次。给药12周后,HE染色观察视网膜病理学改变,ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平,RT-qPCR法检测视网膜组织VEGF、NF-κB、p38 MAPK mRNA表达,Western blot法检测视网膜组织TLR4、p-p38 MAPK、p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表达。结果空白组大鼠体质量随实验周期延长保持正常增长,空腹血糖维持在正常水平;模型组大鼠体质量增长缓慢,造模4周后,体质量逐渐下降,空腹血糖持续保持在较高水平。与空白组比较,模型组大鼠视网膜可观察到明显病理性损伤,血清TNF-α、IL-6水平、视网膜VEGF mRNA表达及TLR4、NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,大黄蛰虫胶囊各剂量组均可改善视网膜病理损伤,抑制血清TNF-α、IL-6水平、视网膜VEGF mRNA表达及TLR4、NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达(P<0.05,P<0.01),且中剂量组作用优于高、低剂量组(P<0.05,P<0.01)。结论大黄蛰虫胶囊可减轻糖尿病大鼠视网膜病理损伤,其可能是通过抑制TLR4/p38 MAPK/NF-κB信号通路发挥抗炎作用。

茶多糖-茶多酚对小鼠肠道氧化应激的改善与作用机制

目的:探究茶多糖-茶多酚混合功能成分(tea extract rich in polysaccharides and polyphenols,TEPP)是否能够改善D-半乳糖诱导的小鼠肠道氧化应激反应,同时探究其抗氧化机制。方法:小鼠腹腔注射质量分数10%D-半乳糖8周建立氧化应激模型,造模成功后,正常组与模型组灌胃蒸馏水,阳性组灌胃200 mg/kg m_(b)还原型谷胱甘肽,TEPP低、中、高剂量组分别灌胃40、100、250 mg/kg m_(b)的TEPP,茶多酚组灌胃50 mg/kg m_(b)的茶多酚。用酶联免疫吸附试验试剂盒检测各组小鼠肠组织的总抗氧化能力、活性氧质量浓度、谷胱甘肽还原酶活力、血红素加氧酶活力,通过实时荧光定量聚合酶链式反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测各组肠组织Toll样受体4(toll-like receptors,TLR4)、p38、核因子NF-E2相关因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、谷胱甘肽还原酶、血红素加氧酶的mRNA表达量。结果:与模型组相比,TEPP高剂量组的总抗氧化能力上升了约2.2倍,谷胱甘肽还原酶、血红素加氧酶活力分别上升了2.8、1.7倍,活性氧浓度降低了72.8%,TLR4、p38的mRNA表达量分别降低了39.1%、82.4%,Nrf2、谷胱甘肽还原酶、血红素加氧酶的mRNA表达量分别升高了83.6%、8.3倍、96.3%,这些指标变化都与模型组存在显著差异(P<0.05)。结论:TEPP能够通过TLR4/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)/Nrf2通路改善D-半乳糖诱导的小鼠肠道的氧化应激反应。

黄芩苷对缺氧/复氧小胶质细胞TLR4通路的影响

目的:模拟脑梗塞时脑组织内的缺氧/再灌注病理过程,探索缺氧/复氧对原代培养的小胶质细胞Toll样受体4(TLR4)通路的影响和黄芩苷的干预作用;方法:原代培养小胶质细胞,采用缺氧/复氧的方式制备模型,用黄芩苷25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L3个浓度梯度进行干预,用逆转录聚合酶链反应检测小胶质细胞TLR4 mRNA的表达,Western Blot检测TLR4、抑制因子(I-кB)、p38、ERK蛋白,免疫荧光双染观察髓性分化因子88(MyD88)和核因子кB(NF-кB)。结果:缺氧/复氧激活了TLR4通路,并通过MyD88依赖途径激活了TLR4和下游蛋白MyD88、NF-кB、ERK、I-кB和p38;黄芩苷高剂量组明显抑制了通路中TLR4、MyD88、NF-кB、ERK与p38蛋白的活性和I-кB蛋白的降解。结论:缺氧/复氧激活了小胶质细胞的TLR4通路,黄芩苷通过对TLR4通路蛋白的抑制降低了小胶质细胞的活性,发挥抗炎效应,促进脑缺血的恢复。

原花青素抑制脂多糖激活神经小胶质细胞的机制

目的:研究原花青素抑制脂多糖(LPS)激活神经小胶质细胞的机制。方法:采用1.0μg/m L LPS刺激神经小胶质细胞建立体外炎症模型,再用不同浓度(0.1、0.5、2.5、10.0μg/m L)原花青素进行干预,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度原花青素对神经小胶质细胞的毒性,ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,Western blot法检测TLR4、p38、p-p38蛋白的表达。结果:与对照组比较,1.0μg/m L LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05),TLR4和p-p38蛋白表达亦显著增加(P<0.05);给予不同浓度原花青素干预后,与1.0μg/m L LPS组比较,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平均下降(P均<0.05),TLR4和pp38蛋白表达水平均显著下调(P均<0.05)。结论:原花青素可能通过TLR4/p38 MAPK信号通路抑制脂多糖激活神经小胶质细胞。