人源抗TLR4抗体IgG2对对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

目的:研究人源抗TLR4抗体IgG2(human-TLR4 IgG2,h TLR4 IgG2)对对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导肝损伤的保护效应,探讨其在药物性肝损伤中的保护作用。方法:以人源抗TLR4抗体Fab基因为模板,扩增其可变区基因,构建人源抗TLR4抗体IgG2真核表达载体,转染CHO-S细胞,筛选稳定表达细胞株,收集细胞上清,Protein G柱纯化抗TLR4抗体IgG2。将18只C57BL/6J小鼠随机分成3组:生理盐水组、APAP(600 mg/kg)组和APAP+hTLR4 IgG2(5 mg/kg)组,统计小鼠腹腔注射APAP后24 h的存活率;重复上述实验分组,检测小鼠腹腔注射APAP 8 h后,血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,取肝脏做病理分析并使用Western blot检测凋亡蛋白的表达。结果:成功构建并表达纯化人源抗TLR4抗体IgG2;ELISA结果显示,抗体效价为1∶204800。与APAP组相比,APAP+hTLR4 IgG2组小鼠的24 h存活率显著增加(P<0.05);血清AST、ALT以及炎性细胞因子的表达水平显著降低,具有统计学意义(P<0.05);病理分析结果显示,与模型组相比,人源抗TLR4抗体IgG2治疗组的小鼠肝组织炎性细胞浸润、充血和坏死等症状明显改善;Western blot结果显示凋亡相关蛋白的表达减少。结论:人源抗TLR4抗体IgG2能够抑制炎症因子的表达及细胞凋亡,对APAP诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用。

丁苯酞联合TLR4抗体鼓室给药小鼠梅尼埃病模型的实验研究

目的研究丁苯酞联合TLR4抗体通过调控Hsp70通道蛋白表达对内淋巴积水(Endolymphatic hydrops,ELH)小鼠模型的诊疗价值。方法选取50只BALB/c雌性小鼠,并随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、和实验组(C组)。对照组不予任何处理;模型组予内淋巴积水造模;实验组在模型组基础上2天后:A组予以鼓室注射TLR4抗体50μg+丁苯酞25mg/kg灌胃干预;B组予以鼓室注射TLR4抗体100μg+丁苯酞100mg/kg灌胃干预;C组予以鼓室注射TLR4抗体200μg+丁苯酞100mg/kg灌胃干预。连续干预4周。随后观察小鼠行为学改变,耳蜗切片Hsp70表达,测试耳蜗电图SP/AP值。检测MD小鼠在丁苯酞联合TLR4抗体干预前后血清Hsp70水平及TNF-α、IL-6炎性细胞因子表达。结果与对照组比较,模型组小鼠诱发出明显外周前庭症状,符合MD(Ménière’s Disease)动物造模改变;与模型组比较,实验组3个亚组经4w鼓室注射TLR4抗体50、100、200μg+丁苯酞25、100、100mg/kg灌胃干预后,小鼠前庭反应都明显减轻,模型组与实验组耳蜗电图SP/AP值分别为0.4169±0.13,0.3271±0.12,两者差异无统计学意义(P>0.05);耳蜗切片Hsp70表达可见耳蜗螺旋神经节和血管纹细胞在实验组呈较强阳性染色,模型组呈强阳性染色,两者对比有统计学意义(P<0.05)。小鼠血清中Hsp70蛋白、TNF-α及IL-6水平较模型组显著减低,两者比较有统计学意义(P<0.05);实验A组与B组相比,随TLR4抗体鼓室注射及丁苯酞灌胃剂量增加,上述指标水平下降。而实验B组与C组相比,当丁苯酞灌胃剂量不变,继续增加TLR4鼓室注射浓度至200μg时,上述指标水平继续下降。结论丁苯酞联合TLR4抗体鼓室给药可明显干预TLR4/Hsp70信号传导通路在MD小鼠内耳的表达。当TLR4抗体鼓室注射浓度增为200μg,对血清Hsp70表达及减轻炎性因子水平的干预作用最大。

TLR4抗体对姬松茸多糖作用巨噬细胞产生细胞因子的影响

目的研究TLR4抗体对巴氏蘑菇多糖(Agaricus blazei Murrill polysaccharide,ABPS)对体外巨噬细胞RAW264.7产生细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子--α(TNF-α)、干扰素-β(IFN-β)的影响。方法相同浓度ABPS及脂多糖(LPS,阳性对照)作用巨噬细胞RAW264.7 3 h、6 h、12 h、18 h和36 h;不同浓度ABPS及LPS作用巨噬细胞RAW264.7 24 h;TLR4抗体作用巨噬细胞RAW264.7 1 h后,更换含有ABPS和LPS的细胞培养液作用24h。收集细胞培养上清,采用ELISA法检测细胞培养上清细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-β的含量。结果 ABPS作用巨噬细胞RWA264.7 24 h后,细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IFN-β含量明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P<0.01),但显著低于LPS组。在一定浓度范围内,细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IFN-β的含量随ABPS浓度增大而增大,浓度为1000μg/ml时IL-1β、TNF-α、IFN-β含量达到最大。TLR4抗体处理的巨噬细胞RAW264.7经ABPS和LPS作用,IL-1β、TNF-α、IFN-β含量低于未处理组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TLR4抗体能够一定程度抑制ABPS作用巨噬细胞RAW264.7产生IL-1β、TNF-α、IFN-β,推测ABPS可能通过TLR4受体信号转导通路影响三种细胞因子的释放。

TLR4单克隆抗体对过敏性紫癜小鼠损伤的保护作用及其机制

目的探究Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)单克隆抗体(mAb)对过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)小鼠损伤的保护作用及其机制。方法将50只C57BL/6健康小鼠随机分为正常对照组、HSP模型组、同型对照组、TLR4 mAb组和西咪替丁阳性对照组。正常对照组不做处理,其余4组小鼠均进行为期14周的HSP模型构建。在模型构建成功后对各组小鼠进行对应药物干预,持续3周。干预结束后,采用碳粒廓清法进行小鼠网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)功能检测;流式细胞术检测小鼠外周血单核细胞中Th17及Treg细胞占比;ELISA法检测小鼠血清中分泌型免疫球蛋白E(secretory-IgE,S-IgE)、IL-17、IL-6、IL-10以及TGF-β的水平;qRT-PCR检测各组小鼠皮肤和肾脏中视黄酸相关性孤儿受体(retinoic acid associated orphan receptorγt,RORγt)及叉头样转录因子3(forkhead helix transcription factor 3,Foxp3)的表达;Western blot检测各组小鼠皮肤和肾脏中TLR4及IL-17蛋白表达;苏木精-伊红染色观察小鼠皮肤和肾脏的组织病理学变化。结果与模型组比较,TLR4 mAb显著增强HSP小鼠RES功能(吞噬指数K及吞噬系数α)(均P<0.01),降低血清S-IgE、IL-17、IL-6水平(均P<0.01),增加血清IL-10及TGF-β水平(均P<0.01)。此外,TLR4 mAb显著改善了HSP小鼠皮肤及肾脏的病理学变化,抑制RORγt在mRNA水平的表达,促进Foxp3在mRNA水平的表达(均P<0.01);同时降低TLR4、IL-17蛋白的表达量。结论 TLR4 mAb对HSP小鼠损伤具有显著的保护作用,其作用机制可能与下调TLR4和IL-17蛋白的表达进而介导Th17/Treg免疫平衡调节有关。

^(125)I标记Toll样受体4-抗体与人单核细胞系THP1的体外结合研究

目的:125I标记Toll样受体4抗体(TLR4)研究其与人单核细胞系THP1细胞体外结合的特性。方法:用125I标记TLR4,以快速硅胶簿层层析纸(ITLC-SG)分析方法鉴定125I标记抗体的放射化学纯度,再用γ计数器测定125I标记抗体与THP1细胞的TLR4结合量,其中特异结合(SB)=总结合管(TB)-非特异管(NSB)。结果:125I标记TLR4-Ab的标记率为80.27%(n=7)。用快速硅胶簿层层析纸(ITLC-SG)分析方法鉴定其放射化学纯度都能>95%,测定125I标记抗体的比活度为3.145TBq.mg-1。结论:125I标记的TLR4-Ab具有良好的标记率和放射化学纯度,且125I标记TLR4-Ab与THP1细胞在体外具有很高结合亲和力。

TLR4mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影响

目的探讨TLR4单克隆抗体(toll like receptor4monoclonal antibodies,TLR4mAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的急性期溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠肠黏膜的促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影响。方法30只BALB/c小鼠分为A-E组,分别为对照组、模型组以及低、中、高剂量干预组。A组小鼠饮用蒸馏水7d;B-E组小鼠仅饮用5%DSS水溶液7d以产生急性期溃疡性结肠炎模型。造模开始的同时,3组干预组小鼠分别给予低、中、高剂量TLR4mAb腹腔内注射,对照组及模型组给予腹腔内注射生理盐水,以观察TLR4mAb的干预作用。观察指标包括疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠组织病理学评分(histopathological score,HPS)。造模及干预7d后处死小鼠,RT-PCR法检测各组肠黏膜TNF-α、IFN-γ、IL-1β的mRNA表达。结果(1)与对照组相比,模型组小鼠结肠黏膜DAI及HPS明显增高(P<0.01)。与模型组相比,在使用TLR4mAb干预后低、中、高剂量组DAI和HPS均有不同程度的缓解,但无明显剂量依赖关系。(2)与模型组相比,在使用TLR4mAb后炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β在小鼠结肠黏膜中的表达均有不同程度的降低,并呈剂量依赖关系。结论TLR4mAb可能通过下调小鼠结肠黏膜促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的mRNA表达而发挥其干预作用。

TLR4mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜中细胞因子IL-17、IL-10及TGF-β的影响

目的探讨TLR4单克隆抗体(toll like receptor 4 monoclonal antibodies,TLR4mAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的急性期溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠肠黏膜的细胞因子IL-17、IL-10及TGF-β的影响情况。方法30只BALB/c小鼠分为A-E组:对照组、模型组以及低、中、高剂量干预组。A组小鼠饮用蒸馏水7 d;B-E组小鼠仅饮用5%DSS水溶液共7d以产生急性期溃疡性结肠炎模型。造模开始的同时,分别给3组干预组小鼠以低、中、高剂量TLR4mAb腹腔内注射以观察其干预作用。观察指标包括疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠组织病理学评分(histopathological score,HPS)。造模及干预7 d后处死小鼠,Real time-PCR法检测各组肠黏膜IL-17I、L-10及TGF-β的mRNA表达。结果(1)与对照组相比,模型组小鼠结肠黏膜DAI及HPS明显增高(P<0.01)。与模型组相比,在使用TLR4mAb干预后低、中、高剂量组DAI和HPS均有不同程度的缓解。(2)与模型组相比,在使用TLR4mAb后低、中、高剂量组细胞因子IL-17I、L-10及TGF-β在小鼠结肠黏膜中的表达均有不同程度的降低。结论TLR4mAb可以抑制肠道免疫的过度激活,减少炎症因子的过度表达,从而反馈性下调抑炎细胞因子的表达,打破促炎/抑炎因子的失衡状态,减轻急性期溃疡性结肠炎的炎症表现。

TLR2 mAb和TLR4 mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜炎症因子IFN-γ、IL-4及IL-17表达的影响

目的探讨TLR2单克隆抗体(toll-like receptor 2 monoclonal antibodies,TLR2 mAb)和TLR4单克隆抗体(toll-like receptor 4 monoclonal antibodies,TLR4 mAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的急性期溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠结肠黏膜的炎症因子IFN-γ、IL-4及IL-17表达的影响。方法50只雄性BALB/c小鼠分为5组(每组10只):对照组(A)、模型组(B)及TLR2 mAb干预组(C)、TLR4mAb干预组(D)、TLR2 mAb和TLR4 mAb联合干预组(E)。A组小鼠饮用蒸馏水7 d;B-E组小鼠仅饮用5%DSS水溶液7 d以产生急性期溃疡性结肠炎模型。造模开始的同时,每隔48 h分别给予C、D、E干预组小鼠以TLR2 mAb(10μg)、TLR4 mAb(10μg)、TLR2 mAb(10μg)+TLR4 mAb(10μg)腹腔内注射,A、B组给予腹腔内注射生理盐水,以观察TLR2 mAb和TLR4 mAb的干预作用。观察指标包括疾病活动指数(disease activityindex,DAI)、结肠组织病理学评分(histopathological score,HS)。造模及干预7 d后处死小鼠,Real-ti me PCR法检测各组结肠黏膜TLR2、TLR4、IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达。结果(1)与A组相比,B组小鼠肠道DAI及HS明显增高(P<0.01)。与B组相比,E组小鼠肠道DAI(P<0.05)和HS(P<0.01)均明显降低。与D组相比,E组小鼠肠道HS明显降低(P<0.05)。(2)与A组相比,B组小鼠结肠黏膜TLR2、TLR4表达明显增高(P<0.01,P<0.05)。与B组相比,C、D、E组小鼠结肠黏膜TLR2、TLR4表达均有不同程度的降低。(3)与A组相比,B组小鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达明显增高(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。与B组相比,C、D、E组小鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达均有不同程度的降低。结论TLR2 mAb和TLR4 mAb可能通过下调小鼠结肠黏膜的炎症因子IFN-γ、IL-4、IL-17的mRNA表达而发挥其干预作用。

TLR1-TLR4在人嗜碱性粒细胞中的表达

目的分别在基因和蛋白水平上观察Toll样受体(Tolllikereceptor,TLR)家族成员中的TLR1、TLR2、TLR3和TLR4在人嗜碱性粒细胞系KU812中的表达。方法取1×106细胞,从细胞中提取总RNA后,用RT-PCR检测细胞中mRNA的表达;用抗人TLR1-TLR4单克隆抗体和小鼠同型抗体行免疫荧光染色后,在流式细胞仪上检测TLR1-TLR4蛋白的表达。结果人嗜碱性粒细胞有TLR1-14mRNA的组成型表达。在流式细胞仪检测中,用抗人TLR1-TLR4单克隆抗体染色的细胞,其荧光强度均明显高于同型对照。结论嗜碱性粒细胞中有TLR-TLR4的组成型表达,提示嗜碱性粒细胞可作为一种免疫细胞对病原微生物进行识别。

TLR2和TLR4单克隆抗体对DSS诱导的小鼠结肠炎肠黏膜细胞因子及肠道菌群的影响

目的 研究Toll样受体2单克隆抗体（Toll-like receptor 2 monoclonal antibody,TLR2McAb）、Toll样受体4单克隆抗体（TLR4McAb）对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎组织学改变及肠道菌群结构的影响.方法 雄性BALB/c小鼠分为正常对照组（A）、急性期溃疡性结肠炎模型组（B）、TLR2McAb干预组（C）、TLR4McAb干预组（D）、TLR2McAb＋TLR4McAb共同干预组（E）,每组10只.A组饮用蒸馏水,B～E组饮用5%DSS水溶液以产生急性期溃疡性结肠炎,造模开始同时,每隔48 h予A、B两组小鼠腹腔内注射生理盐水,C～E组小鼠分别予以10μg的TLR2McAb、TLR4McAb、TLR2McAb＋TLR4McAb,期间观察小鼠的疾病活动指数（disease activity index,DAI）.干预7 d后处死小鼠,HE染色观察结肠炎症,并进行结肠组织病理学评分（histopathological score,HS）;使用real-time PCR法检测各组结肠黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17表达;留取盲肠内粪便对大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌进行培养并比较各菌群菌落计数（colony forming units,CFU）的变化.应用SPSS13.0软件进行统计学分析,以P〈0.05为差异有统计学意义.结果 （1）与A组比较,B组的DAI及HS显著增高（DAI：9.700±2.406 vs 0.500±0.707,P〈0.01;HS：16.500±2.991 vs 6.400±3.273,P〈0.01）;C、D组与B组比较DAI及HS差异均无统计学意义（P〉0.05）;E组的DAI及HS明显低于B组（DAI：5.700±3.498 vs 9.700±2.406,P〈0.05;HS：9.500±3.308 vs 16.500±2.991,P〈0.01）.（2）与A组比较,B组小鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达明显增高;而C～E组结肠黏膜三种细胞因子的表达均有不同程度的降低.（3）A组大肠杆菌数量较少,B～E四组大肠杆菌均明显生长（与A组比较P〈0.05）,C～E组大肠杆菌数值与B组比较有所下降,但差异无统计学意义（P〉0.05）;B组双歧杆菌及乳酸杆菌数量均明显少于A组及C～E组（P〈0.05）,使用TLR2McAb、TLR4McAb干预后,C～E组双歧杆菌及乳酸杆菌数量上升,与A组比较差异无统计学意义（P〉0.05）.结论 TLR2McAb、TLR4McAb同时干预对DSS诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎有显著改善作用;两种McAb均能明显提高小鼠肠道内双歧杆菌及乳酸杆菌的菌群数量,从而改善肠道菌群结构,但对大肠杆菌数量无明显影响,且两抗体同时干预对肠道菌群结构的改善未见显著协同作用.

广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用受体TLR4和TLR2的影响

确定广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用受体,探索广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫调节机制。采用MTT法测定不同浓度广叶绣球菌β-D-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响,筛选出促进巨噬细胞增殖能力最强的浓度。用筛选出的β-D-葡聚糖浓度作用巨噬细胞RAW264.7;TLR4抗体和TLR2抗体分别作用巨噬细胞RAW264.71h,再用含有β-D-葡聚糖的细胞培养液培养。收集细胞培养上清和细胞,检测细胞培养上清中NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量;提取细胞内总RNA,采用RT-PCR测定巨噬细胞TLR4 mRNA表达量;提取巨噬细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹western blot测定TLR4的蛋白表达。广叶绣球菌β-D-葡聚糖能够促进巨噬细胞RAW264.7增殖,增加NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量,提高TLR4 mRNA表达和蛋白表达,差异极显著(P<0.01)。TLR4抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量明显下降,差异极显著(P<0.01)。TLR2抗体作用细胞后,NO、IL-6、TNF-α、IFN-β的生成量下降,但差异不显著。广叶绣球菌β-D-葡聚糖可以通过细胞表面受体TLR4激活信号转导通路,增强下游细胞因子的释放,从而调节巨噬细胞RAW264.7的免疫功能。TLR2可能不是广叶绣球菌β-D-葡聚糖的免疫受体。

人TLR4的B细胞优势表位设计、合成及其免疫原性检测

目的 鉴定TLR4的优势抗原表位 ,为抗人TLR4单克隆抗体制备奠定基础。方法 分别应用Hoop&Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数和抗原表位的软件分析对TLR4B细胞表位进行预测 ,最后用抗原性指数的方法进行综合评述。合成针对该表位的多肽 ,以此多肽为免疫原免疫小鼠 ,对其免疫原性进行检测。结果 预测TLR4的B细胞优势表位为 189～ 2 0 2氨基酸序列 :NH2 HKLTLRNNFDSLNV COOH ,此多肽能诱导机体产生较高的抗体滴度 ,多抗具有较高的特异性。结论 预测的TLR4短肽是B细胞的优势表位 ,以此制作抗人TLR4单克隆抗体是可行的。

TLR4mAb抑制mmLDL损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能

目的探讨预先使用TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)对轻度氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)诱发小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能损伤的影响及作用机制。方法实验分为:空白对照组、mmLDL处理组、TLR4mAb干预组。采用ELISA方法测定血浆中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度水平,微血管张力描记技术测定血管内皮依赖性舒张功能,Western blot技术和RT-PCR技术分别考察血管组织蛋白表达量和mRNA表达水平,透射电镜观察肠系膜动脉内皮细胞超显微结构。结果 TLR4mAb剂量依赖性改善mmLDL损伤血管内皮依赖性舒张功能的损伤作用,显著上调K_(Ca)3. 1-通道、K_(Ca)2. 3-通道蛋白表达和下调炎症因子TNF-α和IL-1β表达。TLR4mAb改善mmLDL损伤血管内皮细胞及内皮依赖性舒张功能,可能与其竞争性拮抗mmLDL激活TLR4信号转导通路及其下游的NF-κBp65和p-38MAPK通路有关。结论预先使用TLR4mAb可以减轻mmLDL所诱发的内皮细胞损伤和内皮依赖性舒张功能降低,以及抑制炎症因子的过度表达,调控TLR4通路及其下游的NF-κBp65和p-38MAPK通路可能是预防治疗心血管疾病的有效靶点。

Toll样受体4单克隆抗体对慢加急性肝功能衰竭大鼠的保护作用

目的观察Toll样受体4(TLR4)单克隆抗体对慢加急性肝功能衰竭大鼠的治疗效果以及对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的影响。方法采用人血白蛋白,D-氨基半乳糖以及LPS联合诱导的大鼠慢加急性肝功能衰竭模型,并应用TLR4单克隆抗体作为干预剂以及兔抗鼠IgG作为对照,观察TLR4单克隆抗体对慢加急性肝功能衰竭大鼠的肝脏组织学、血清ALT、TNF-α、IFN-γ、HMGB1水平以及肝组织中HMGB1水平的影响。结果 TLR4单克隆抗体能够明显改善慢加急性肝功能衰竭大鼠肝脏组织病理学损害,降低血清中ALT、TNF-α、IFN-γ和HMGB1水平,并且降低肝组织中HMGB1水平(P均<0.05)。而与模型组相比,以上指标在对照组中差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 TLR4单克隆抗体能够保护慢加急性肝功能衰竭大鼠并减少HMGB1胞外释放以及肝组织中HMGB1的产生。