TLR4-MyD88-NF-kB信号通路与肝炎-肝纤维化-肝癌轴相关性研究进展

Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子88(MyD88)-核转录因子κB(NF-κB)信号通路是疾病理变反应中的关键通路,广泛存在于各组织细胞中,是介导炎性因子在细胞内与细胞之间相互表达的重要信号通路之一。研究发现TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在肝免疫异常、炎症反应触发的肝损伤、肝星状细胞的活化及肝纤维化恶化与肝癌的发展中均有重要调节作用。该信号通路在"肝炎-肝纤维化-肝癌轴"(IFC轴)的动态变化与肝癌的转移中可能是一个关键的调节点。本文就TLR4-MyD88-NF-κB信号通路参与IFC轴疾病病理机制的最新研究进展作一综述,为以后相关研究提供参考。

紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响

目的探讨支架涂层复合物紫杉醇水蛭素对脂多糖(LPS)诱导人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响。方法选用4-6代的HCASMC,用四唑盐(MTT)比色法筛选出紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性大、小两个浓度,使细胞活力保持在90%以上。进而将细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)造模组、LPS造模+紫杉醇水蛭素大浓度组、LPS造模+紫杉醇水蛭素小浓度组,其中大、小浓度紫杉醇水蛭素复合物处理组在LPS造模前预处理细胞4 h,继而用Q-PCR法对TLR4和MyD88 mRNA进行检测,并用Western blotting法检测对应蛋白表达的变化。结果 1μmol/L的紫杉醇配比0.8 mg/ml水蛭素对HCASMC生长有明显的抑制作用,细胞活力与空白对照组相比差异明显(P<0.05)。1μmol/L的紫杉醇配比0.4 mg/ml水蛭素干预后细胞活力降低为78.7%,对细胞生长产生了一定影响,其余各浓度组细胞活力均能保持在90%以上。紫杉醇水蛭素复合物预处理细胞4 h后,Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,LPS造模后可同时激活TLR4、MyD88的mRNA表达(P<0.05),HCASMC炎症模型构建成功。各干预组经紫杉醇水蛭素处理后,与单纯LPS模型组相比,TLR4的mRNA基因表达量显著降低(P<0.05),但不影响MyD88基因表达(P>0.05)。Western blotting结果显示:与空白对照组相比,LPS模型组TLR4、MyD88蛋白表达明显升高(P<0.05),成功构建了稳定的HCASMC炎症模型。经紫杉醇水蛭素处理后,各干预组TLR4、MyD88蛋白表达较LPS模型组显著降低(P<0.05),其中紫杉醇水蛭素大浓度组的抗炎作用相对更强。结论紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC细胞炎性活化过程中TLR4-MyD88通路的激活具有明显的抑制作用,此抑制作用不通过影响MyD88基因表达来产生,而可能与其对MyD88蛋白水平的调控有关。

薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路调节作用研究

目的:研究薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路的调节作用。方法:将大鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元低、中、高剂量组及阳性对照组,每组12只。采用四血管阻断法建立缺血性脑卒中大鼠模型,薯蓣皂苷元各剂量组分别灌胃给予12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg的薯蓣皂苷元,阳性对照组给予大鼠尼莫地平,1次/d,连续21 d。测定给药前后大鼠神经功能缺损评分,使用Morris水迷宫测定大鼠逃避潜伏期及90 s内穿过平台的次数;酶联免疫吸附(ELISA)法测定脑组织Toll样受体(TLR)-2、白介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;苏木精—伊红(HE)染色法测定脑组织病理改变;实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及免疫印迹法(Western blotting)测定大鼠脑组织TLR4、MyD88、TRIF mRNA及蛋白水平。结果:与缺血性脑卒中模型组比较,薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平,脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA及蛋白水平均明显降低(均P<0.05),90 s内穿越平台次数显著增加(P<0.05),大鼠脑组织病理性变化明显恢复,且各项指标变化与薯蓣皂苷元的剂量表现出依赖性。结论:薯蓣皂苷元能够修复缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及神经损伤,抑制脑组织炎症反应,其机制可能与调节TLR4-MyD88/TRIF信号通路有关。

化合物W3D通过调控TLR4-MyD88-NF-κB通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的释放

目的建立脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型,探究新型苯并噁唑酮衍生物4-(5'-二甲氨基)-萘磺酰氧基苯并噁唑酮(W3D)的抗炎活性及其对TLR4-MyD88-NF-κB通路的调控作用。方法 MTT法测定化合物W3D对细胞活力的影响;LPS与不同浓度的化合物W3D共同作用RAW264.7细胞后,ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的含量,Western blot法检测IL-6、TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB的蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测细胞中TLR4、MyD88、IL-6 mRNA的表达。结果化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌有明显的抑制作用,但对COX-2无抑制活性;可明显下调TLR4、MyD88、IL-6的蛋白与mRNA的表达,抑制IRAK4磷酸化和NF-κB的入核活化。结论化合物W3D可通过调控TLR4-MyD88-IRAK4-NF-κB信号通路,抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放而发挥抗炎活性。

脂多糖通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞激活模型的建立

目的探讨不同活化程度的BV2小胶质细胞与炎性介质之间的关系及可能的细胞信号转导途径,建立高效稳定的BV2小胶质细胞激活模型。方法体外常规培养BV2小胶质细胞,CCK-8法绘制细胞生长曲线;采用不同浓度的脂多糖(LPS)(0.25、0.5、1、2、4μg/mL)诱导BV2小胶质细胞24 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;应用CCK-8法和Griess法分别检测细胞活性和一氧化氮(NO)水平;应用蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)蛋白和mRNA的表达。同时选取浓度为1μg/mL的LPS诱导BV2小胶质细胞24 h,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)浓度。结果 CCK-8法和Griess法结果显示:BV2小胶质细胞传代培养后第2~3天处于对数生长期;LPS能明显降低BV2小胶质细胞存活率及提高NO释放量(均P<0.05),且在实验剂量范围内呈现剂量-效应关系。Western blot和qRT-PCR结果显示:TLR4、MyD88 mRNA及蛋白的表达随着LPS浓度增加呈现先升高后降低的趋势,且均在LPS为1μg/mL时达到峰值(均P<0.05)。ELISA结果显示:LPS(1μg/mL)显著提高TNF-α和IL-1β浓度,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 LPS可能通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞活化,进而上调其炎性介质的水平;1μg/mL LPS是建立高效稳定BV2小胶质细胞激活模型的最佳浓度。

卡维地洛对肝纤维化动物模型TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响及其抗肝纤维化的作用机制

目的探讨卡维地洛对肝纤维化动物模型TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响及其抗肝纤维化的作用机制。方法将60只SD大鼠作为研究对象,随机分为空白对照组、模型组以及低、中、高剂量卡维地洛组,每组各12只。采用胆总管结扎法建立模型组和卡维地洛组大鼠的肝纤维化模型,并于造模成功后48 h开始,低、中、高剂量卡维地洛组每天分别灌胃给药药液0.5、1.0、1.5 mg/kg;空白对照组和模型组灌胃等量蒸馏水。干预4 w后比较各组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)水平、炎症因子[白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平以及肝纤维化血清指标[羟脯氨酸(Hyp)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原肽(PIIINP)]水平。并取出每组大鼠的肝脏左叶组织进行切片,采用常规HE染色和Masson三色染色后于显微镜下观察对比肝脏纤维化程度;采用Westernblot法检测各组大鼠肝组织中NF-κB与TLR4/MyD88蛋白表达水平;采用实时定量PCR法检测NF-κB与TLR4/MyD88 mRNA水平。结果HE及Masson三色染色结果显示模型组大鼠肝纤维模型造模成功,与空白对照组比较,模型组IL-1、IL-6、TNF-α、ALT、AST以及Hyp、LN、PIIINP水平明显升高(P<0.05),ALB水平水平明显下降(P<0.05);干预4 w后,低、中、高剂量卡维地洛组大鼠血清ALT、AST、炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平以及Hyp、LN、PIIINP相比模型组明显下降(P<0.05),ALB水平明显上升(P<0.05),且随着给药剂量增加,各因子水平改善更显著。模型组大鼠TLR4、MyD88和NF-κB蛋白及mRNA表达水平相比空白对照组明显升高(P<0.05)。不同剂量卡维地洛干预后,随着剂量增加,TLR4、MyD88和NF-κB蛋白及mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论卡维地洛可能通过调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路调控TLR4、MyD88以及NF-κB蛋白表达,发挥抑制肝脏炎症反应和抗纤维作用,从而改善肝纤维化程度。

基于TLR4/MYD88/NF-κB通路研究降脂通脉饮对高脂血症模型大鼠的影响

目的:基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MYD88)/核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路探讨降脂通脉饮对高脂血症模型大鼠的影响。方法:从15只SD大鼠中随机选取3只作为空白组,其余大鼠给予高脂饲料2周建立高脂血症模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、降脂通脉饮低剂量组(1.56 mg·kg^(-1))、降脂通脉饮中剂量组(3.125 mg·kg^(-1))、降脂通脉饮高剂量组(6.25 mg·kg^(-1)),每组各3只,给予相应剂量药物8周,每日1次,空白组和模型组给予生理盐水灌胃。全自动生化仪检测大鼠血清血脂水平,包括总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C);ELISA检测血清炎症因子含量,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ);Western Blot和qPCR检测颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白和基因表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05);各组大鼠血清HDL-C水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),降脂通脉饮低剂量组大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠颈动脉组织TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量、中剂量、高剂量组大鼠颈动脉组织TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:降脂通脉饮可降低高脂血症大鼠血脂水平,其机制可能与抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,从而减轻炎症反应有关。

哮喘丸抑制顽固性咳嗽及其对TLR4-MyD88-NF-κBp65信号通路的调控作用

目的:咳嗽变异性哮喘是顽固性咳嗽的主要病因。观察哮喘丸对咳嗽变异性哮喘大鼠的治疗效果,并进一步探讨其作用机制。方法:选用4%鸡蛋清白蛋白和2%的Al(OH)3共同致敏大鼠,建立咳嗽变异性哮喘大鼠模型。模型大鼠分别灌胃给予低、中、高剂量(0.9,1.8,3.6 g/kg)哮喘丸或孟鲁司特钠,每天1次,连续14 d,并于干预7,14 d后从各组分别随机取5,10只大鼠用于采集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和气管、肺组织。对BALF中的白细胞及嗜酸性粒细胞计数;采用ELISA试剂盒检测各组大鼠BALF中IFN-γ,IL-1β,TNF-α的水平;对各组大鼠肺组织行病理学检查,观察其组织形态学变化;采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肺组织中TLR4,MyD88,NF-κBp65和p-p65的蛋白质表达。结果:哮喘丸能明显减少变异性哮喘模型大鼠BALF中白细胞及嗜酸性粒细胞的数目(P<0.05或P<0.01),并能改善气管及支气管黏膜上皮增生和肺组织炎症细胞浸润程度;干预14 d,与模型对照组比较,哮喘丸高剂量组IFN-γ水平明显升高(P<0.01),IL-1β和TNF-α水平明显降低(均P<0.05),大鼠肺组织TLR4,MyD88,p-p65及p65的蛋白质表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:哮喘丸对大鼠顽固性咳嗽具有治疗作用,其作用机制可能与调控气道TLR4-MyD88-NF-κBp65信号通路,调节炎症和免疫反应有关。

葛根素通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用

目的:研究葛根素(puerarin)通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用。方法:小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病小鼠模型,分为糖尿病模型组(模型组)、二甲双胍组、葛根素组,另设正常对照组。正常对照组和模型组小鼠灌胃予生理盐水,二甲双胍组灌胃予二甲双胍320 mg/kg·d^(-1),葛根素组腹腔注射葛根素65 mg/kg·d^(-1),各实验组共干预4周。每周测定各组小鼠的空腹血糖(FBG),称量体重,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清肌酐、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠肾组织病理损伤情况,免疫组化观察Toll样受体-4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)蛋白在肾组织的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组FBG、肌酐、IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.05),肾小球增大,肾组织正常结构被破坏,肾小球基底膜增厚,且肾组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达增多(P<0.05);与模型组比较,葛根素组的FBG、Scr、IL-6、TNF-a的含量明显降低(P<0.05),减轻肾组织损伤,肾组织TLR4、MyD88、NF-κB表达减少(P<0.05)。结论:葛根素对糖尿病小鼠肾损伤具有明显的改善作用,可能与其调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。

黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠TLR4-MyD88信号通路的影响

目的分析黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠的作用及对Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子(MyD88)信号通路的影响。方法将50只SPF级无交配史SD雌性大鼠按随机数字表法分为模型组、对照组和黄芪甲苷低、中、高剂量组,每组10只,除对照组外均构建子宫内膜异位症模型。黄芪甲苷低、中、高剂量组分别给予20、40、80 mg/kg黄芪甲苷灌胃处理,对照组、模型组灌胃等量生理盐水,连续给药28 d。测量各组大鼠异位子宫内膜体积;测定血清性激素指标雌二醇(E_(2))、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH),以主炎症因子指标肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8水平;苏木精-伊红染色观察子宫内膜组织病理变化;蛋白质印迹法(Western blotting)检测子宫内膜异位组织中TLR4-MyD88信号通路蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠异位子宫内膜体积增大(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);与对照组相比,模型组大鼠移植内膜生长,被覆柱状上皮,间质较多,可见炎性浸润,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠异位子宫内膜体积缩小(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平下降(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠移植内膜变少,生长不完整,腺体减少或消失,腺上皮萎缩,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平均降低(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05)。结论黄芪甲苷可剂量依赖地抑制子宫内膜异位症大鼠异位病灶生成,下调性激素水平,降低炎症反应,抑制TLR4-MyD88信号通路激活。

基于TLR4-MyD88依赖通路白喉乌头单体Ⅰ抑制树突状细胞成熟的作用机制

目的研究白喉乌头单体I(Delvestidine)抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟的分子机制,进一步评价白喉乌头的药效。方法提取小鼠骨髓来源单核细胞,体外LPS诱导为BMDCs,设立正常组、LPS组、LPS+Delvestidine 20μg/mL组、LPS+Delvestidine 40μg/mL组、LPS+Delvestidine 80μg/mL组,流式细胞术检测各组BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况,筛选Delvestidine最适浓度;设立正常组、LPS组、LPS+Delvestidine 80μg/mL组,ELISA法检测各组BMDCs上清液中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)含量,qRT-PCR和Western blot法检测各组BMDCs中TLR4-MyD88依赖通路关键基因和蛋白的表达情况。结果LPS组CD80+CD86+细胞比例明显高于正常组(P<0.05),LPS+Delvestidine各组CD80+CD86+细胞比例均明显低于LPS组(P均<0.05),且LPS+Delvestidine 80μg/mL组明显低于LPS+Delvestidine 20μg/mL组和LPS+Delvestidine 40μg/mL组(P均<0.05),Delvestidine的最适给药浓度为80μg/mL。与正常组比较,LPS组IL-10含量明显降低(P<0.05),IL-6含量和TLR4-MyD88依赖通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与LPS组比较,LPS+Delvestidine 80μg/mL组IL-10含量明显升高(P<0.05),IL-6含量和TLR4-MyD88依赖通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论Delvestidine可抑制BMDCs的成熟及活化,其作用机制可能与TLR4-MyD88依赖通路有关。

当归芍药散基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对阿尔茨海默病模型大鼠神经炎症的影响研究

目的研究当归芍药散对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)诱导的阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)模型大鼠神经炎症及Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调控作用。方法SD大鼠大脑双侧侧脑室注射Aβ1-42构建AD动物模型。实验分为假手术组、模型组、当归芍药散组和阳性药物组。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,当归芍药散组给予当归芍药散24 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,阳性药物组给予米诺环素36 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,连续灌胃14 d。Morris水迷宫实验测定大鼠的学习记忆能力。复制模型成功后取材,HE染色检测海马神经元组织病理形态学变化,免疫荧光法检测小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况,实时荧光定量PCR(qPCR)检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达情况,免疫印迹法(Western Blot)检测TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白的表达水平,免疫组化法检测NF-κB p65核转位的情况。结果与假手术组比较,AD大鼠学习记忆能力明显下降(P<0.01),海马组织神经元形态受损,小胶质细胞和星形胶质细胞活化增加(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.01),TLR4、MyD88蛋白表达水平明显上升,p-NF-κB p65与NF-κB p65的比值明显增高(P<0.01),NF-κB p65在胞核的表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较,当归芍药散组和阳性对照组AD大鼠学习记忆能力明显提高(P<0.01,P<0.05),大鼠海马组织神经元形态功能明显恢复,小胶质细胞和星形胶质细胞活化减少(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.01),TLR4、MyD88蛋白表达水平明显降低(P<0.01),p-NF-κB p65与NF-κB p65的比值明显降低(P<0.01),NF-κB p65在胞核的表达明显减少(P<0.01)。结论当归芍药散可能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制神经炎症反应,发挥神经保护作用。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨左归丸、右归丸影响骨关节炎模型的作用机制研究

目的利用细胞、分子生物学技术,采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)检测方法,观察左归丸与右归丸对大鼠膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)软骨细胞、韧带组织的作用机制及细胞凋亡的影响,并讨论左归丸组与右归丸治疗膝骨关节炎的作用机制。方法选取8月龄的无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级别Wistar大鼠40只(250±20 g),雌鼠与雄鼠各20只,使用数字随机法分组,分为正常组、模型对照组、左归丸组、右归丸组、硫酸氨基葡萄糖组,每组各8只大鼠(雌雄各4只),造模方法为膝关节腔注射0.1 mL浓度为10%的木瓜蛋白酶溶液,每隔2 d造模1次,共进行3次造模,每次造模后驱赶大鼠30 min,用此方法对模型对照组、左归丸组、右归丸组、硫酸氨基葡萄糖组大鼠进行模型复制。模型复制成功后分别对5组大鼠进行相应干预。连续治疗4周后,所有大鼠取腹主动脉血后处死,Elisa法检测各组大鼠血清白细胞介素(IL)-1β表达水平,取出膝关节软骨及韧带组织,RT-PCR法与WB法检测软骨及韧带组织中toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、IκB激酶(IKK)蛋白及mRNA的表达。剩余膝关节组织HE染色检测软骨组织情况。采用SPSS 22.0软件包对检测结果进行方差分析,P<0.05差异有统计学意义。结果(1)膝关节病理切片结果:经左、右归丸治疗后KOA炎症减轻。(2)RT-PCR检测结果:软骨和韧带组织中,较模型组对比左归丸组与右归丸组TLR4、IKK表达含量明显减少(P<0.05)。(3)WB检测结果:软骨和韧带组织中,较模型组对比左归丸组与右归丸组TLR4、IKK蛋白含量明显降低(P<0.05)。(4)Elisa法检测结果:各组大鼠血清中,左归丸组与右归丸组IL-1β表达水平明显降低(P<0.05)。结论左归丸与右归丸可通过抑制TLR4/髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路活化,降低TLR4、IKK、IL-1β的表达,达到保护软骨细胞及韧带组织、控制炎症、促进受损组织恢复的目的。

白藜芦醇通过MyD88/TLR4/NF-kB信号通路诱导结肠癌细胞凋亡的机制

目的探讨白藜芦醇通过MyD88/TLR4/NF-kB信号通路影响结肠癌细胞凋亡的机制。方法选取不同剂量白藜芦醇处理24 h后的结肠癌细胞,TUNEL法检测细胞凋亡率的变化,利用RT-PCR和Western blot检测白藜芦醇处理后结肠癌细胞MyD88/TLR4/NF-kB信号通路中关键信号分子的表达变化。结果中高剂量白藜芦醇处理结肠癌细胞系HT-29、sw480和LoVo后,细胞凋亡率显著上升;Bcl-2蛋白和mRNA含量表达下降,Bax、cleaved-Caspase 3蛋白和mRNA含量表达显著升高;细胞上清中VEGF蛋白表达明显降低;细胞中MyD88、TLR4、NF-kB和mRNA含量均明显降低。结论白藜芦醇可能通过MyD88/TLR4/NF-kB信号通路促进结肠癌细胞凋亡从而抑制肿瘤发生发展。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨小青龙汤对寒饮内蕴型慢性肾小球肾炎大鼠的作用机制

目的探讨小青龙汤基于Toll样受体4/髓样分化因子88/核转录因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信号通路对慢性肾小球肾炎(CGN)大鼠的治疗效果及作用机制。方法50只健康Wistar雄性大鼠,随机选8只作为正常组(Normal),对剩余42只大鼠施加低温环境、冰水游泳、冷食冷饮5周,阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导CGN产生。模型制备成功后,随机分为模型组,小青龙汤低剂量组、小青龙汤中剂量组、小青龙汤高剂量组。小青龙汤灌胃15 d后,收集24 h尿液,麻醉后,腹主动脉取血,取两侧肾脏。进行24 h尿蛋白、尿素氮(BUN)、血清白蛋白(ALB)、血清肌酐(Scr)含量测定;酶联免疫吸附测定试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)含量;苏木素-伊红(HE)染色进行肾脏病理组织观察;免疫组化(IHC)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织TLR4、MyD88、NF-κB p65的蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达情况。结果与正常组相比,模型组大鼠24 h尿蛋白含量明显升高(P<0.01);血清中BUN、Scr、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8含量明显升高(P<0.01),ALB含量明显降低(P<0.01);模型组大鼠肾组织有炎性细胞浸润,肾小球结构紊乱,肾小球系膜细胞严重增生,肿胀,部分膜细胞脱落,明显病变;与正常组比较,模型组大鼠肾组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.01)。与模型组比较,小青龙汤高剂量组大鼠24 h尿蛋白含量明显降低(P<0.01);小青龙汤中、高剂量组大鼠血清BUN、Scr含量显著降低(P<0.01),小青龙汤低、中、高剂量组ALB含量明显升高(P<0.05,P<0.01);小青龙汤中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8含量显著降低(P<0.01);小青龙汤中、高剂量组较模型组肾小球系膜细胞增生明显减轻,炎性细胞减少,肾组织结构趋于正常;小青龙汤中、高剂量组大鼠肾组织中的TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.01);小青龙汤低、中、高剂量组大鼠肾组织中的TLR4、MyD88 mRNA表达显著降低(P<0.01),小青龙汤高剂量组大鼠肾组织中的NF-κB p65 mRNA明显降低(P<0.05)。结论寒饮内蕴型CGN大鼠模型的造模方法具有可行性;小青龙汤治疗CGN大鼠可能是通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的表达,并使该通路所介导的TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8炎症因子减少,进而降低CGN大鼠肾脏炎症反应,减少尿蛋白的产生,改善肾功能。

异氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带TLR4-MyD88信号通路的影响

目的探讨异氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带TLR4-MyD88信号通路的影响。方法成年雄性SD大鼠54只，体重250～280g，采用随机数字表法，将其随机分为3组（n=18）：假手术组（S组）、脑缺血再灌注组（I／R组）和异氟醚预处理组（1P组）。S组仅分离血管不留置线栓；I／R组采用线栓法制备右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2h，再灌注24h；IP组吸入2．0％异氟醚2h，预处理结束后24h时制备右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注24h时行神经功能缺陷评分，随后处死大鼠，每组随机抽取5只大鼠，取脑组织，测定脑梗死体积，采用Westernblot法和RT—PCR法检测大鼠右侧脑缺血半暗带区HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA的表达情况；每组剩余的3只大鼠，采用TUNEL法检测大鼠右侧脑缺血半暗带区细胞凋亡情况。结果与S组比较，I／R组和IP组神经功能缺陷评分升高，脑梗死体积增大，右侧脑缺血半暗带区凋亡指数升高，HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达均上调（P〈0．05）；与I／R组比较，IP组神经功能缺陷评分降低，脑梗死体积减小，右侧脑缺血半暗带区凋亡指数降低，HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达均下调（P〈0．05）。结论异氟醚预处理可保护脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带，其机制可能与抑制大鼠脑缺血半暗带TLR4-MyDg8信号通路有关。

基于TLR4/MyD88/NF-κB与p38 MAPK信号通路研究麻杏石甘汤减轻咳嗽变异性哮喘大鼠炎症反应的作用及机制

探讨麻杏石甘汤对咳嗽变异性哮喘(CVA)大鼠炎症反应的作用及机制。6~8周龄SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、孟鲁司特钠组以及麻杏石甘汤低、中、高剂量组,每组8只;采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)_(3)]致敏并用OVA激发的方法复制大鼠CVA模型,正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,各受试药组给予相应药物灌胃。实验结束后,检测各组大鼠血液白细胞计数,血清白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;蛋白免疫印迹法检测肺组织中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和磷酸化核转录因子-κB p65(p-p65)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)水平,实时荧光定量分析法检测肺组织中TLR4、MyD88 mRNA表达水平。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠具有明显哮喘表型,血液白细胞计数和IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01),IL-10水平显著降低(P<0.01),气道周围炎症细胞浸润明显,细胞排列紊乱,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平以及TLR4、MyD88 mRNA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,孟鲁司特钠组、麻杏石甘汤高剂量组白细胞计数和IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01),气道炎症细胞浸润、细胞排列紊乱程度明显减轻,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平以及TLR4、MyD88 mRNA水平显著降低(P<0.01)。与孟鲁司特钠组比较,麻杏石甘汤高剂量组大鼠血液白细胞数,血清中IL-10和TNF-α含量,肺组织中TLR4、MyD88、p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平及TLR4、MyD88 mRNA水平,均无显著差异。麻杏石甘汤具有抑制CVA大鼠气道炎症反应的作用,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB以及p38 MAPK信号通路的激活相关。

miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的巨噬细胞焦亡探讨黄芩黄连药对治疗动脉粥样硬化的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)信号通路介导的巨噬细胞焦亡探讨黄芩黄连药对(芩连药对)治疗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法:体外培养J774A.1细胞,SD大鼠灌胃芩连药对后制备含药血清,MTT法筛选芩连药对含药血清最佳干预浓度。采用不同浓度的含药血清预处理J774A.1细胞后,给予脂多糖(LPS)+三磷酸腺苷(ATP)诱导焦亡。光学显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)释放法及Hoechst 33342/碘化丙锭(PI)染色用于检测细胞的损伤情况,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-18的水平。Western Blot法检测通路及焦亡相关蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleave-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT的表达。TLR4基因过表达后,检测通路相关蛋白表达水平及细胞焦亡情况。结果:芩连药对含药血清可改善造模后J774A.1的形态;提高造模后J774A.1细胞的活力、降低LDH释放率及PI细胞阳性率(P<0.05);降低细胞上清液中IL-1β及IL-18的水平(P<0.05);显著下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及焦亡相关蛋白的表达(P<0.05);同时过表达TLR4可逆转芩连药对对J774A.1细胞焦亡的保护作用(P<0.05)。结论:芩连药对可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路降低巨噬细胞焦亡水平,从而发挥抗AS的作用。

麻杏石甘汤对流感病毒肺部感染模型肺组织TLR2/4-MyD88信号通路蛋白表达的影响

目的:从肺组织TLR2/4-MyD88信号通路蛋白表达水平探索麻杏石甘汤抗流感病毒效应机制。方法:经鼻腔接种建立流感病毒肺部感染模型,设正常对照组、模型对照组、奥司他韦组、抗病毒口服液组、麻杏石甘汤组。各治疗组经灌胃给药3、7 d,常规法检测肺指数、肺指数抑制率;HE染色法观察肺组织的病理变化;免疫组织化学法和免疫印迹法检测肺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。结果:与正常对照组比较,模型对照组肺指数显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,给药治疗3 d的麻杏石甘汤组肺指数显著降低(P<0.05)。与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织充血水肿,大量炎症细胞浸润;与模型对照组比较,给药治疗3、7 d的麻杏石甘汤组小鼠肺组织病理损伤得到明显改善。免疫组化结果显示:给药3 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织内TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著下降(P<0.05);给药7 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织内MyD88蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织内MyD88蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。免疫印迹法显示:给药3 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织内TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织各蛋白表达水平显著降低(P<0.05);给药7 d,各组间差异无统计学意义。结论:麻杏石甘汤可能是通过调节TLR2/4-MyD88信号通路相关蛋白的表达水平而发挥抗流感病毒作用。