基于TLR4-MyD88依赖通路白喉乌头单体Ⅰ抑制树突状细胞成熟的作用机制

目的研究白喉乌头单体I(Delvestidine)抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟的分子机制,进一步评价白喉乌头的药效。方法提取小鼠骨髓来源单核细胞,体外LPS诱导为BMDCs,设立正常组、LPS组、LPS+Delvestidine 20μg/mL组、LPS+Delvestidine 40μg/mL组、LPS+Delvestidine 80μg/mL组,流式细胞术检测各组BMDCs表面标记CD80、CD86表达情况,筛选Delvestidine最适浓度;设立正常组、LPS组、LPS+Delvestidine 80μg/mL组,ELISA法检测各组BMDCs上清液中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)含量,qRT-PCR和Western blot法检测各组BMDCs中TLR4-MyD88依赖通路关键基因和蛋白的表达情况。结果LPS组CD80+CD86+细胞比例明显高于正常组(P<0.05),LPS+Delvestidine各组CD80+CD86+细胞比例均明显低于LPS组(P均<0.05),且LPS+Delvestidine 80μg/mL组明显低于LPS+Delvestidine 20μg/mL组和LPS+Delvestidine 40μg/mL组(P均<0.05),Delvestidine的最适给药浓度为80μg/mL。与正常组比较,LPS组IL-10含量明显降低(P<0.05),IL-6含量和TLR4-MyD88依赖通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与LPS组比较,LPS+Delvestidine 80μg/mL组IL-10含量明显升高(P<0.05),IL-6含量和TLR4-MyD88依赖通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、Ikk2 mRNA和蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论Delvestidine可抑制BMDCs的成熟及活化,其作用机制可能与TLR4-MyD88依赖通路有关。

美沙拉嗪对小鼠溃疡性结肠炎模型中Let-7i-5p/TLR4/MyD88依赖性通路的调控机制

目的:本研究旨在探讨美沙拉嗪(MSLZ)对小鼠2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)模型中Let-7i-5p和TLR4/MyD88依赖通路的调控机制。方法:采用TNBS/乙醇结肠法建立溃疡性结肠炎(UC)模型。将44只雄性小鼠随机分为对照组、模型组、MSLZ组和Let-7i-5p抑制剂组,每组11只。小鼠灌胃或腹腔注射相应的药物或生理盐水,连续14d。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测小鼠结肠组织中和血清中Let-7i-5p的表达水平。在显微镜下,用苏木精和伊红(HE)染色观察结肠组织的病理病变。分别采用qRT-PCR,Western blot和免疫组化方法检测小鼠结肠组织中TLR4/MyD88依赖通路相关基因的mRNA和蛋白水平。通过ELISA检测小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达水平。结果:根据疾病活跃指数(DAI)、结肠损伤和病理病变的评分,成功构建了小鼠UC模型。模型组小鼠结肠组织中和血清中Let-7i-5p的表达水平显著高于对照组(P<0.0001)。与模型组相比,MSLZ和Let-7i-5p抑制剂处理均能显著抑制Let-7i-5p的表达(P<0.0001)。与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中TLR4/MyD88依赖通路相关基因(包括TLR4、MyD88、TRAF-6和NF-κB)的mRNA和蛋白水平显著上调。MSLZ和Let-7i-5p抑制剂处理均能显著抑制这些基因的表达,且MSLZ的抑制作用略强于Let-7i-5p抑制剂。与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-α的mRNA水平和血清中的蛋白水平显著上调,MSLZ和Let-7i-5p抑制剂处理均能抑制IL-1β和TNF-α的表达水平。结论:在TNBS/乙醇诱导的UC小鼠模型中,MSLZ可以抑制结肠组织中和血清中Let-7i-5p的表达。此外,MSLZ还通过抑制UC小鼠的TLR4/MyD88依赖性通路来抑制炎症因子的释放。

鸦胆子苦醇通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的机制研究

目的探究鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的分子机制。方法针对本实验室保存的Hela细胞,使用不同浓度(0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 nmol·L^(-1))的鸦胆子苦醇处理细胞。并将Hela细胞分为Control组(正常培养的Hela细胞)、BRU-L组(使用10.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)BRU-H组(使用20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)、BRU+pcDNA-NC组(转染pcDNANC+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)、BRU-H+pcDNA-TLR9组(转染pcDNA-TLR9+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和EdU法检测各组细胞增殖情况;TUNNEL染色法,经流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞TLR9、MyD88、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)情况、ELISA检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和活性氧基团(ROS)含量。结果与0 nmol·L^(-1)组比较,10 nmol·L^(-1)组细胞活存活率、IC50值开始显著降低(P<0.05)。不同浓度的BRU刺激细胞后,细胞增殖能力显著降低,且呈剂量依赖(P<0.05)。。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)阳性细胞率、缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著降低,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显增加(P<0.05);Control组、BRU-L、BRU-H组/BRU-H+pcDNA-NC呈持续递减/递减趋势(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组EDU阳性细胞率、TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著升高,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显降低(P<0.05)。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞JC-1水平和ATP含量显著降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平显著增加(P<0.05);与BRU-L组比较,BRU-H组、BRU-H+pcDNANC组JC-1水平和ATP含量进一步降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平进一步增加(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组细胞JC-1水平和ATP含量增加,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可通过调控TLR9-MyD88信号通路制Hela细胞增殖。

麦粒灸对坐骨神经损伤大鼠脊髓组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的影响

目的观察麦粒灸“环跳”对坐骨神经损伤(SNI)大鼠坐骨神经功能、坐骨神经干病理形态及脊髓组织TLR4/MyD88/NF-κB表达的影响,探究麦粒灸治疗SNI的可能机制。方法24只雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组和麦粒灸组,每组6只。模型组、麦粒灸组采用坐骨神经钳夹制备SNI大鼠模型,造模后第7日起麦粒灸组取患侧“环跳”麦粒灸干预,每次6壮,1次/d,连续10 d。观察造模后第7日及干预结束后大鼠坐骨神经功能指数(SFI)、纤维丝测痛仪测量大鼠机械痛阈值(MWT),ELISA检测脊髓组织一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量,HE染色观察坐骨神经干形态,Western blot检测脊髓组织Toll样受体4(TLR4)、核因子(NF)-κBp65、p-NF-κBp65、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、p-IκBα蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠SFI、MWT显著降低(P<0.01),坐骨神经干神经纤维排列紊乱,施万细胞数量明显增多,有大量空泡变性,脊髓组织NO、iNOS含量及TLR4、p-NF-κBp65、MyD88、p-IκBα蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,麦粒灸组大鼠SFI、MWT显著升高(P<0.01),坐骨神经干损伤减轻,细胞排列较整齐,施万细胞数量减少,轴突脱髓鞘及细胞空泡变性减少,脊髓组织NO、iNOS含量及TLR4、p-NF-κBp65、MyD88、p-IκBα蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论麦粒灸“环跳”可下调SNI大鼠脊髓组织TLR4、p-NF-κBp65、MyD88、p-IκBα蛋白表达,抑制NO、iNOS分泌,从而缓解疼痛、减轻受损神经组织炎症反应。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨复方银翘合剂缓解哮喘小鼠炎症反应的作用研究

目的:研究复方银翘合剂对哮喘小鼠的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将72只小鼠随机分为6组,正常组、模型组、复方银翘合剂低、中、高剂量组和阳性药物组,每组12只。采用卵清蛋白诱导小鼠哮喘模型,观察小鼠一般症状并检测IgE浓度。收集小鼠肺泡灌洗液并染色计数,HE染色观察小鼠肺组织病理变化。ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13的水平。Western blot法检测肺组织中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)和核转录因子κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠肺泡灌洗液中总细胞数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞均显著增多(P<0.05),巨噬细胞显著减少(P<0.05),肺组织中支气管管壁增厚,炎性细胞浸润,TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13的水平均显著提高(P<0.05),TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,复方银翘合剂中、高剂量组小鼠肺泡灌洗液中总细胞数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞均显著减少(P<0.05),巨噬细胞显著增多(P<0.05),TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13的水平均显著降低(P<0.05),TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。复方银翘合剂各剂量组比较结果显示,高剂量组的上述变化最明显。结论:复方银翘合剂可缓解哮喘小鼠症状,减轻肺组织病理变化和炎症水平,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

复方佛耳草合剂对慢性阻塞性肺疾病大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 探讨复方佛耳草合剂对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响。方法 大鼠随机分为空白组(10只)和造模组(50只),造模组连续12周采用香烟烟雾联合气管注射LPS建立COPD大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、地塞米松组(0.5 mg/kg)和复方佛耳草合剂低、中、高剂量组(6.8、13.6、27.2 g/kg),每组10只。给药干预24周后,采用动物肺功能仪检测大鼠肺功能,HE染色法观察肺组织病理变化,ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平及SOD活性,RT-qPCR法检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB及caspase-3 mRNA表达,Western blot法检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB及TNF-α蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠存在肺通气功能障碍,肺组织和支气管受损明显,SOD活性降低(P<0.01),血清TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平升高(P<0.01),肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA表达和TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,复方佛耳草合剂各剂量组均能够改善肺功能指标,修复受损肺组织,降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平(P<0.05,P<0.01),降低肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA表达和TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α蛋白表达(P<0.05,P<0.01),且复方佛耳草合剂的作用呈剂量依赖性。结论 复方佛耳草合剂可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺功能障碍与病理损伤,其机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关。

益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的探讨益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠的影响。方法48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益气活血方组、单硝酸异山梨酯组。除假手术组外,所有大鼠行冠状动脉结扎术。术后7 d,除假手术组外,其余大鼠强迫游泳14 d,并控制大鼠的食量,同时益气活血方组和单硝酸异山梨酯组大鼠予灌胃给药28 d。心脏超声检测大鼠心功能;全血黏度检测大鼠的瘀血程度;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色检测大鼠心脏病理形态改变;Masson染色检测大鼠心肌纤维化水平;荧光定量PCR和免疫组化检测大鼠心肌组织Toll样受体(toll-like receptor,TLR)4、髓样分化因子(myeloid differentiationfactor,MyD)88和核因子(nuclear-factor,NF)-κB p65的mRNA和蛋白表达量;ELISA检测大鼠血清中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的含量。结果与假手术组比较,模型组大鼠心功能下降(P<0.01),全血黏度升高(P<0.01),心肌组织排列紊乱,心肌损伤范围较大,心肌纤维化严重(P<0.01),心肌中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平上调(P<0.01),血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量升高(P<0.01);与模型组比较,药物干预后,大鼠心功能改善(P<0.05),全血黏度下降(P<0.01),心肌组织排列较整齐,心肌损伤范围缩小,心肌纤维化缓解(P<0.01),TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平下调(P<0.05),血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量减少(P<0.05)。结论益气活血方能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路介导的炎症反应发挥对冠心病气虚血瘀证大鼠的治疗作用。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究清眩润目饮对苯扎氯铵诱导的干眼大鼠的作用机制

目的:基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨清眩润目饮对苯扎氯铵(BAC)诱导干眼模型大鼠的作用机制。方法:将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、清眩润目饮组、玻璃酸钠组,每组10只(20眼)。除空白组外,各组大鼠采用0.2%BAC滴眼,5μL/眼,2次/d,连续14 d,制备大鼠干眼模型。造模后,清眩润目饮组予中药灌胃,同时予磷酸盐缓冲液滴眼;玻璃酸钠组大鼠予等量生理盐水灌胃及玻璃酸钠滴眼液滴眼;空白组和模型组予等量生理盐水灌胃及磷酸盐缓冲液滴眼,2次/d,连续14 d。末次给药1 h后对各组大鼠行泪液分泌量检测(SIT)及角膜荧光素钠染色(FL)评分;透射电镜观察角膜细胞超微结构;HE染色观察结膜组织病理学变化;RT-qPCR检测各组大鼠角膜、结膜及泪腺中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB p65 m RNA的表达;ELISA检测各组大鼠角膜、结膜及泪腺中磷酸化p65(p-p65)蛋白的表达。结果:造模14 d后,模型组、清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠SIT低于空白组(P<0.01),FL评分高于空白组(P<0.01)。给药14 d后,清眩润目饮组、玻璃酸钠组大鼠SIT均高于模型组(P<0.01或P<0.05),FL评分均低于模型组(P<0.05)。透射电镜显示模型组大鼠角膜间隙增大,面积增宽,排列不规则;清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠角膜上皮细胞间隙增宽程度减轻,排列较规则,角膜结构改善。HE染色显示,与模型组比较,清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠结膜上皮细胞形态及排列恢复,杯状细胞数量上升。模型组大鼠角膜、结膜及泪腺中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA相对表达量高于空白组(P<0.01);清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠角膜、结膜及泪腺中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.01);清眩润目饮组大鼠角膜中TLR4 mRNA及结膜、泪腺中MyD88 mRNA相对表达量均低于玻璃酸钠组(P<0.01)。模型组大鼠角膜、结膜及泪腺中p-p65蛋白表达水平均高于空白组(P<0.01);清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠角膜、结膜及泪腺中p-p65蛋白表达水平均低于模型组(P<0.01);清眩润目饮组大鼠角膜及结膜中p-p65蛋白表达水平低于玻璃酸钠组(P<0.05)。结论:清眩润目饮可缓解BAC诱导干眼模型大鼠的干眼症状,修复角膜、结膜损伤,其机制可能是抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。

消肿止痛合剂通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路诱导小鼠小胶质细胞的M2极化

目的:观察消肿止痛合剂(Xiaozhong-Zhitong mixture,XZZT)对小鼠小胶质细胞(BV2细胞)M2极化和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路的影响。方法:将BV2细胞分为空白组、模型组[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+缺氧]、TAK-242(TLR4抑制剂)组(LPS+缺氧+TAK-242)、XZZT组(LPS+缺氧+XZZT)和TAK-242+XZZT组(LPS+缺氧+TAK-242+XZZT)共5组。流式细胞术检测BV2细胞的早期凋亡及细胞周期;免疫荧光染色检测M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和M2型标志物CD206的阳性表达;Western blot检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65、磷酸化p65(phosphorylated p65,p-p65)、磷酸化转化生长因子β活化激酶1(phosphorylated transforming growth factor-β-activated kinase 1,p-TAK1)和磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β(phosphorylated IκB kinaseα/β,p-IKKα/β)水平;RT-qPCR检测白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA表达水平。结果:与模型组相比,XZZT组中BV2细胞早期凋亡率显著降低(P<0.01),生长周期阻滞于S期的细胞比例显著升高(P<0.01),TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-IKKα/β、p-p65和p-TAK1蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01),IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),IL-10的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与TAK-242组相比,TAK-242+XZZT组iNOS平均阳性面积百分率显著降低,CD206平均阳性面积百分率显著升高(P<0.01)。结论:XZZT具有诱导小鼠小胶质细胞M2极化的作用,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨清宫汤对广泛性焦虑症大鼠神经炎症的影响

目的探讨清宫汤通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对广泛性焦虑症(GAD)大鼠焦虑样行为的影响。方法将48只大鼠随机分为对照组、模型组、劳拉西泮组(0.09 mg/kg)和清宫汤高、中、低剂量组(20.34、10.17、5.09 g/kg)。除对照组外,其他各组大鼠均采用不确定空瓶刺激和慢性束缚应激的方法制备GAD模型。造模成功后,各组给予相应剂量药物干预14 d。通过高架十字迷宫实验(EPM)、旷场实验(OFT)和明暗箱实验(LDB)检测各组大鼠的焦虑样行为,ELISA法检测大鼠血清和海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平,RT-qPCR法检测海马组织TLR4、MyD88、NF-κB p 65 mRNA表达,Western blot法检测海马组织TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达,免疫荧光法检测NF-κB p65入核情况。结果与对照组比较,模型组大鼠在EPM、OFT、LDB中的探索行为学指标降低(P<0.05,P<0.01),血清和海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.01),海马组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达升高(P<0.01),p-NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01),海马组织NF-κB p65入核增多;与模型组比较,清宫汤高剂量组行为学指标升高(P<0.01),清宫汤高、中剂量组血清和海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05,P<0.01),清宫汤各剂量组海马组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),p-NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.01),NF-κB p65入核减少。结论清宫汤可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化,降低促炎因子水平,进而缓解GAD大鼠的焦虑样行为。

补虚化瘀方及其拆方对脂多糖诱导的人肝内胆管上皮细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 观察补虚化瘀方及其拆方对脂多糖(LPS)诱导的人肝内胆管上皮细胞(HIBEC)细胞外基质及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响,探讨其改善原发性胆汁性胆管炎(PBC)炎症病变的相关机制。方法 将48只SD大鼠随机分为空白组、补虚组、化瘀组、补虚化瘀方组,每组12只。补虚组、化瘀组、补虚化瘀方组分别灌以相应中药水煎液,空白组灌以等量的生理盐水,每日1次,连续灌胃2周,灌胃结束后取血制备含药血清;将不同处理因素的HIBEC分为正常组、模型组(5μg/mL脂多糖)、补虚组、化瘀组、补虚化瘀方组;CCK8法筛选最佳干预浓度,检测各组细胞活力;免疫荧光检测各组NF-κB激活-核转运状态;Western blot检测各组TLR4、MyD88、NF-κB p65、P-NF-κB p65目的蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组细胞培养上清液中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的含量。结果 (1) CCK8结果显示,15%含药血清为最佳干预浓度;与正常组及模型组相比,化瘀组细胞活力增加(P<0.05),补虚化瘀方组细胞活力增加明显(P<0.01);(2)免疫荧光检测显示,与正常组比较,模型组NF-κB亚基从细胞浆大量转运到细胞核内,光密度明显增强(P<0.01);与模型组、补虚组、化瘀组相比,补虚化瘀方含药血清组转运到细胞核内的NF-κB亚基明显减少,光密度减弱(P<0.01);(3) Western blot结果显示,与正常组比较,模型组TLR4、MyD88、NF-κB p65、P-NF-κB p65蛋白表达增加(P<0.01);与模型组比较,补虚组NF-κB p65、P-NF-κB p65蛋白表达减少(P<0.01),化瘀组P-NF-κB p65蛋白表达减少(P<0.01),补虚化瘀方组TLR4、MyD88、NF-κB p65、P-NF-κB p65蛋白表达明显减少(P<0.01);(4) ELISA检测显示,与正常组比较,模型组IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10分泌增多(P<0.01);与模型组比较,补虚组、化瘀组IL-6、MCP-1、CXCL10分泌减少(P<0.01),补虚化瘀方组IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10分泌明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论 相对于模型组、补虚组、化瘀组,补虚化瘀方全方组能增加HIBEC的细胞活力,显著抑制脂多糖诱导的HIBEC中IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL10的分泌,方中补虚、化瘀两组药物存在协同作用,全方可发挥最大疗效,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活密切相关。

苦参及其炮制品对湿热型溃疡性结肠炎小鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的调节作用

目的 通过探讨苦参及其炮制品对湿热型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)模型小鼠的治疗作用及其可能的作用机制,为苦参炮制品的临床合理应用提供参考。方法 在持续高温高湿环境下,配合高糖高脂饲料及蜂蜜水,建立湿热型小鼠模型,进而通过自由饮用含3%葡聚糖硫酸钠(DSS)的蒸馏水,建立湿热型UC小鼠模型。实验分为空白组、模型组、阳性药组(美沙拉嗪300 mg/kg)、生苦参组、麸炒苦参组、米泔制苦参组(均按5 g/kg剂量给药)、麦麸辅料组、米泔水辅料组,UC造模同时给予灌胃给药,连续10 d。每日观察小鼠的一般情况、体质量、粪便性状及隐血情况,进行一般疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分,给药结束后处死小鼠,摘取结肠并测量长度,苏木精-伊红(HE)染色观察病理切片,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)以及结肠组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR,RT-PCR)和Western blot法检测结肠组织中Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)mRNA及蛋白表达。结果 与模型组比较,苦参及其炮制品组DAI评分降低;结肠长度缩短程度减小(P<0.01),结肠病变程度减轻,淋巴细胞浸润程度减轻;血清中MIF、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8含量降低(P<0.01),IL-10含量升高(P<0.01);结肠组织中MDA含量降低(P<0.01),SOD水平升高(P<0.01);TLR4、MyD88,NF-κBp65 mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。麦麸辅料和米泔水辅料组较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。麸炒苦参组、米泔制苦参组较生苦参组作用更明显(P<0.05,P<0.01)。结论 苦参及其炮制品具有治疗湿热型UC的作用,经麸炒或米泔制后效果更好,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,抗氧化应激、抗炎有关。

miR-223-3p调节TLR4/MyD88/NF-κB通路影响脂多糖诱导的肺癌A549细胞炎症反应

目的:探讨miR-223-3p对脂多糖诱导的肺癌A549细胞炎症反应的影响。方法:实验分成2部分,每个部分分为2组,共4组:miRNA阴性对照(mimic NC)+LPS组,miR-223-3p模拟物(miR-223-3p mimic)+LPS组;miR-223-3p mimic+BAY11-7082+LPS组,miR-223-3p mimic+等量溶剂(vehicle)+LPS组。随后利用Western blot实验检测每组TLR4/MyD88/NF-κB表达水平,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测促炎细胞因子水平,CCK-8法检测细胞活力。结果:与mimic NC+LPS组相比,miR-223-3p mimic+LPS组的TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表达水平低,促炎细胞因子分泌少以及细胞活力高。与miR-223-3p mimic+BAY11-7082+LPS组相比,miR-223-3p mimic+vehicle+LPS组的TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表达水平低,促炎细胞因子分泌少以及细胞活力高。结论:miR-223-3p可以通过抑制TLR4/My D88/NF-κB促进A549细胞增殖、抑制促炎细胞因子的分泌,从而抑制肺癌中炎症的发生,本研究为今后临床上肺癌的治疗及药物开发提供了新策略。

脑蛋白水解物联合长春西汀通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路治疗重症高血压性脑出血的疗效及机制

目的 探究脑蛋白水解物联合长春西汀通过Toll样受体(TLR)4/髓样分化因子(MyD)88/核因子(NF)-κB信号通路治疗重症高血压性脑出血的疗效及机制。方法 选择102例重症高血压性脑出血患者随机分为两组各51例,对照组给予复方丹参液治疗,实验组给予脑蛋白水解物联合长春西汀治疗。于治疗前后分别检测患者临床指标变化、神经功能评分;检测血清氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)变化;检测血清内皮功能指标人内皮素(ET)-1,血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)变化;检测TLR4/MyD88信号通路、TLR4、MyD88和核因子(NF)-κB水平。结果 治疗前两组临床指标、神经功能评分、血清SOD、GSH-Px、MDA、ET-1、VEGF、NGF、TLR4、MyD88、NF-κB水平无显著差异(P>0.05);治疗后,与对照组相比,实验组临床相关指标、美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS)评分降低,格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分和Barthel指数评分升高,SOD和GSH-Px水平升高,MDA、ET-1水平降低,VEGF和NGF水平升高,TLR4、MyD88、NF-κB水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 脑蛋白水解物联合长春西汀可改善重症高血压性脑出血患者神经功能,其机制与降低氧化损伤和TLR4/MyD88/核因子(NF)-κB信号通路的调控有关。

基于TLR4/MyD88/MAPK信号通路探讨脉络舒通丸抗血栓性浅静脉炎的作用机制研究

[目的]探讨脉络舒通丸抗血栓性浅静脉炎(STP)的作用机制。[方法]将36只日本大耳白兔随机分为正常组、模型组、脉络舒通丸低、中、高剂量组、地奥司明组(阳性药对照),每组6只。除正常组外,其余各组均采用耳缘静脉注射20%甘露醇建立STP兔模型。造模同时各给药组连续灌胃给药14 d。苏木精-伊红(HE)染色法检测各组兔耳组织病理变化;酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平;测定凝血4项;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测耳组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和c-氨基酸末端激酶(JNK)蛋白表达及相关磷酸化水平。[结果]与正常组比较,模型组病理损伤评分显著增加(P<0.01);血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平明显升高(P<0.05);活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)缩短,纤维蛋白原(FIB)含量升高(P<0.05);TLR4、MyD88、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK,包括p38MAPK、ERK1/2和JNK)蛋白及相关磷酸化水平均显著上调(P<0.01)。与模型组比较,脉络舒通丸低、中、高剂量组、地奥司明组兔耳组织病理损伤显著改善,病理损伤评分明显降低(P<0.05或P<0.01);血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);APTT、PT、TT明显延长,FIB含量明显降低(P<0.05或P<0.01);TLR4、MyD88、MAPK(p38MAPK、ERK1/2和JNK)蛋白及相关磷酸化水平均显著下调(P<0.05或P<0.01)。[结论]脉络舒通丸可能通过抑制TLR4/MyD88/MAPK信号通路,减轻炎症反应,改善凝血功能,从而发挥抗血栓性浅静脉炎作用。

中医药介导TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在原发性干燥综合征的机制探讨

原发性干燥综合征(primary Sjogren's syndrome,pSS)作为风湿免疫科常见病,困扰着广大患者,不仅给患者带来身体和心理上的负担,长期的临床用药也造就了巨大的经济压力。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与pSS的发生发展及治疗的多个环节。中医药在治疗pSS的过程中具有其优势,无论是单味药还是复方都在临床中效果显著。基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨中医药治疗pSS机制对于中医药及临床诊治pSS具有重大意义。

基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨丁苯酞对氧糖剥夺诱导的人脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的 基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨丁苯酞对氧糖剥夺诱导的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)损伤的影响。方法 采用随机数字表法,将HBMEC分为对照组(Control组)、糖氧剥夺组(OGD组)、丁苯酞低、中、高剂量组(NBP-L、M、H组)和丁苯酞高剂量+pcDNA3-TLR4组(NBP-H+pcDNA3-TLR4组)。采用CCK-8、Transwell法和划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力;ELISA检测细胞中氧化应激指标(SOD、MDA)和炎症因子水平(IL-6、IL-8、TNF-α);蛋白质印迹法检测细胞中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达。结果 和Control组相比,OGD组细胞存活率(41.26%±3.78%)、侵袭细胞数(95.36±7.81)、划痕愈合率(41.16%±3.21%)、细胞中SOD活性(8.71±0.69)均明显降低,细胞中MDA含量(65.42±5.69)、IL-6(89.41±7.52)、IL-8(83.91±7.86)、TNF-α(95.67±8.62)含量明显升高(P<0.05);和OGD组相比,NBP-L、M、H组细胞存活率、侵袭细胞数、划痕愈合率、细胞中SOD活性均明显增加,细胞中MDA含量、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显降低,且呈剂量依赖(P<0.05);和NBP-H组相比,NBP-H+pcDNA3-TLR4组细胞存活率(46.34%±3.89%)、侵袭细胞数(101.43±8.02)、划痕愈合率(45.33%±3.46%)、细胞中SOD活性(9.40±0.73)均明显降低,细胞中MDA含量(59.16±5.43)、IL-6(80.89±7.41)、IL-8(80.51±7.46)、TNF-α含量(90.81±7.40)明显升高(P<0.05)。和Control组相比,OGD组细胞中TLR4(1.45±0.14)、MyD88蛋白(1.32±0.14)表达及p-NF-κB/NF-κB比值(1.18±0.12)均明显升高(P<0.05);和OGD组相比,NBP-L、M、H组细胞中TLR4、MyD88蛋白表达及p-NF-κB/NF-κB比值均含量明显降低,且呈剂量依赖(P<0.05);NBP-H+pcDNA3-TLR4组细胞中TLR4(1.39±0.13)、MyD88蛋白(1.26±0.13)表达及p-NF-κB/NF-κB比值(1.02±0.11)明显高于NBP-H组(P<0.05)。结论 丁苯酞可改善氧糖剥夺诱导的HBMEC损伤,其作用机制可能和调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

清瘟败毒饮通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制内毒素引起的小鼠急性肺损伤

目的:研究清瘟败毒饮对内毒素引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠的保护作用。方法:72只昆明小鼠,随机分为正常组、模型组、地塞米松组、清瘟败毒饮高、中、低剂量组。膜腔注射脂多糖(LPS)建立ALI模型。给药第3 d、第7 d,每组各取6只小鼠处死。采集小鼠的血液,分离小鼠肺组织,测定小鼠肺组织湿干比(湿重/干重,W/D);ELISA与PCR检测小鼠血清及肺组织的相关因子表达;观察小鼠肺组织病理变化。结果:与模型组相比,清瘟败毒饮各剂量组小鼠肺组织病理损伤减轻,肺组织W/D下降,小鼠血清的白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α),肺组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)、TLR4 mRNA、MyD88 mRNA的表达水平降低,且不同剂量组之间呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:清瘟败毒饮对LPS造成的小鼠急性肺损伤有保护作用。

EGCG调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对特应性皮炎大鼠Th1/Th2平衡的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对特应性皮炎(AD)大鼠的保护作用及潜在机制。方法 将SPF级SD大鼠分为对照(Control)组、AD模型(AD)组、AD+EGCG治疗(EGCG)组、AD+地塞米松阳性对照(DXM)组、AD+EGCG+TLR4激动剂(TLR4)组,每组18只。根据临床损伤严重程度计算皮肤损伤评分;ELISA检测炎症因子的表达;HE染色观察组织学变化;流式细胞仪分析Th1和Th2阳性细胞比例;Western blot检测TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白水平。结果 与Control组比较,AD组大鼠背部皮肤损伤程度较重,病理学损伤评分增加(P<0.05),白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及Th1细胞百分比降低,白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13)水平及Th2细胞百分比升高(P<0.05),TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平升高(均P<0.05)。与AD组比较,EGCG组和DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分降低,Th_1细胞百分比、IL-2、IFN-γ水平升高,IL-4、IL-13水平、Th_(2)阳性百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平下降(均P<0.05)。与EGCG组比较,DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分、Th_1、Th_(2)细胞百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平差异无统计学意义(均P>0.05),TLR4组大鼠皮损评分及皮肤损伤病理学评分升高,皮损组织中Th_1细胞百分比降低,Th_(2)阳性百分比及TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上调(均P<0.05)。结论 EGCG可以通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,维持Th1/Th2平衡来抑制炎症反应,进而降低AD的严重程度。

基于TLR4/MYD88/NF-κB通路研究降脂通脉饮对高脂血症模型大鼠的影响

目的:基于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MYD88)/核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路探讨降脂通脉饮对高脂血症模型大鼠的影响。方法:从15只SD大鼠中随机选取3只作为空白组,其余大鼠给予高脂饲料2周建立高脂血症模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、降脂通脉饮低剂量组(1.56 mg·kg^(-1))、降脂通脉饮中剂量组(3.125 mg·kg^(-1))、降脂通脉饮高剂量组(6.25 mg·kg^(-1)),每组各3只,给予相应剂量药物8周,每日1次,空白组和模型组给予生理盐水灌胃。全自动生化仪检测大鼠血清血脂水平,包括总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C);ELISA检测血清炎症因子含量,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ);Western Blot和qPCR检测颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白和基因表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05);各组大鼠血清HDL-C水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),降脂通脉饮低剂量组大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠颈动脉组织TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量、中剂量、高剂量组大鼠颈动脉组织TLR4 mRNA、MYD88 mRNA、NF-κB mRNA表达水平降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:降脂通脉饮可降低高脂血症大鼠血脂水平,其机制可能与抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,从而减轻炎症反应有关。