CpG-c41分子对TLR7-MyD88依赖型信号通路的交叉干扰作用

目的探讨TLR9强力拮抗剂CpG-c41分子对TLR7-MyD88依赖型信号通路的交叉干扰作用。方法体外实验采用ELISA法检测CpG-c41对TLR7激动剂ssRNA83刺激RAW264.7细胞24 h诱发的炎症介质TNF-α和IL-6表达的影响,Western blot检测CpG-c41对TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα蛋白表达的影响;体内实验采用ELISA法检测CpG-c41对ssRNA83攻击BALB/c小鼠2 h诱发血清中TNF-α和IL-6表达的影响作用。结果体内、体外实验均表明,CpG-c41分子能够显著抑制经ssRNA83刺激诱发TLR7-MyD88依赖型信号通路介导的炎症介质TNF-α和IL-6的释放(P<0.01),体外实验表明抑制作用具有量效关系;而Western blot检测显示在CpG-c41作用下,TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα的降解受干扰。结论 TLR9强力拮抗剂CpG-c41分子通过干扰TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα的磷酸化降解,抑制炎症介质的释放,发挥对ssRNA攻击小鼠的免疫保护作用。

鸦胆子苦醇通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的机制研究

目的探究鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的分子机制。方法针对本实验室保存的Hela细胞,使用不同浓度(0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 nmol·L^(-1))的鸦胆子苦醇处理细胞。并将Hela细胞分为Control组(正常培养的Hela细胞)、BRU-L组(使用10.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)BRU-H组(使用20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)、BRU+pcDNA-NC组(转染pcDNANC+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)、BRU-H+pcDNA-TLR9组(转染pcDNA-TLR9+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和EdU法检测各组细胞增殖情况;TUNNEL染色法,经流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞TLR9、MyD88、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)情况、ELISA检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和活性氧基团(ROS)含量。结果与0 nmol·L^(-1)组比较,10 nmol·L^(-1)组细胞活存活率、IC50值开始显著降低(P<0.05)。不同浓度的BRU刺激细胞后,细胞增殖能力显著降低,且呈剂量依赖(P<0.05)。。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)阳性细胞率、缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著降低,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显增加(P<0.05);Control组、BRU-L、BRU-H组/BRU-H+pcDNA-NC呈持续递减/递减趋势(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组EDU阳性细胞率、TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著升高,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显降低(P<0.05)。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞JC-1水平和ATP含量显著降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平显著增加(P<0.05);与BRU-L组比较,BRU-H组、BRU-H+pcDNANC组JC-1水平和ATP含量进一步降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平进一步增加(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组细胞JC-1水平和ATP含量增加,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可通过调控TLR9-MyD88信号通路制Hela细胞增殖。

葛根素通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用

目的:研究葛根素(puerarin)通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用。方法:小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病小鼠模型,分为糖尿病模型组(模型组)、二甲双胍组、葛根素组,另设正常对照组。正常对照组和模型组小鼠灌胃予生理盐水,二甲双胍组灌胃予二甲双胍320 mg/kg·d^(-1),葛根素组腹腔注射葛根素65 mg/kg·d^(-1),各实验组共干预4周。每周测定各组小鼠的空腹血糖(FBG),称量体重,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清肌酐、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠肾组织病理损伤情况,免疫组化观察Toll样受体-4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)蛋白在肾组织的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组FBG、肌酐、IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.05),肾小球增大,肾组织正常结构被破坏,肾小球基底膜增厚,且肾组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达增多(P<0.05);与模型组比较,葛根素组的FBG、Scr、IL-6、TNF-a的含量明显降低(P<0.05),减轻肾组织损伤,肾组织TLR4、MyD88、NF-κB表达减少(P<0.05)。结论:葛根素对糖尿病小鼠肾损伤具有明显的改善作用,可能与其调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。

黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠TLR4-MyD88信号通路的影响

目的分析黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠的作用及对Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子(MyD88)信号通路的影响。方法将50只SPF级无交配史SD雌性大鼠按随机数字表法分为模型组、对照组和黄芪甲苷低、中、高剂量组,每组10只,除对照组外均构建子宫内膜异位症模型。黄芪甲苷低、中、高剂量组分别给予20、40、80 mg/kg黄芪甲苷灌胃处理,对照组、模型组灌胃等量生理盐水,连续给药28 d。测量各组大鼠异位子宫内膜体积;测定血清性激素指标雌二醇(E_(2))、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH),以主炎症因子指标肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8水平;苏木精-伊红染色观察子宫内膜组织病理变化;蛋白质印迹法(Western blotting)检测子宫内膜异位组织中TLR4-MyD88信号通路蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠异位子宫内膜体积增大(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);与对照组相比,模型组大鼠移植内膜生长,被覆柱状上皮,间质较多,可见炎性浸润,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠异位子宫内膜体积缩小(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平下降(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠移植内膜变少,生长不完整,腺体减少或消失,腺上皮萎缩,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平均降低(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05)。结论黄芪甲苷可剂量依赖地抑制子宫内膜异位症大鼠异位病灶生成,下调性激素水平,降低炎症反应,抑制TLR4-MyD88信号通路激活。

紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响

目的探讨支架涂层复合物紫杉醇水蛭素对脂多糖(LPS)诱导人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响。方法选用4-6代的HCASMC,用四唑盐(MTT)比色法筛选出紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性大、小两个浓度,使细胞活力保持在90%以上。进而将细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)造模组、LPS造模+紫杉醇水蛭素大浓度组、LPS造模+紫杉醇水蛭素小浓度组,其中大、小浓度紫杉醇水蛭素复合物处理组在LPS造模前预处理细胞4 h,继而用Q-PCR法对TLR4和MyD88 mRNA进行检测,并用Western blotting法检测对应蛋白表达的变化。结果 1μmol/L的紫杉醇配比0.8 mg/ml水蛭素对HCASMC生长有明显的抑制作用,细胞活力与空白对照组相比差异明显(P<0.05)。1μmol/L的紫杉醇配比0.4 mg/ml水蛭素干预后细胞活力降低为78.7%,对细胞生长产生了一定影响,其余各浓度组细胞活力均能保持在90%以上。紫杉醇水蛭素复合物预处理细胞4 h后,Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,LPS造模后可同时激活TLR4、MyD88的mRNA表达(P<0.05),HCASMC炎症模型构建成功。各干预组经紫杉醇水蛭素处理后,与单纯LPS模型组相比,TLR4的mRNA基因表达量显著降低(P<0.05),但不影响MyD88基因表达(P>0.05)。Western blotting结果显示:与空白对照组相比,LPS模型组TLR4、MyD88蛋白表达明显升高(P<0.05),成功构建了稳定的HCASMC炎症模型。经紫杉醇水蛭素处理后,各干预组TLR4、MyD88蛋白表达较LPS模型组显著降低(P<0.05),其中紫杉醇水蛭素大浓度组的抗炎作用相对更强。结论紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC细胞炎性活化过程中TLR4-MyD88通路的激活具有明显的抑制作用,此抑制作用不通过影响MyD88基因表达来产生,而可能与其对MyD88蛋白水平的调控有关。

薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路调节作用研究

目的:研究薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路的调节作用。方法:将大鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元低、中、高剂量组及阳性对照组,每组12只。采用四血管阻断法建立缺血性脑卒中大鼠模型,薯蓣皂苷元各剂量组分别灌胃给予12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg的薯蓣皂苷元,阳性对照组给予大鼠尼莫地平,1次/d,连续21 d。测定给药前后大鼠神经功能缺损评分,使用Morris水迷宫测定大鼠逃避潜伏期及90 s内穿过平台的次数;酶联免疫吸附(ELISA)法测定脑组织Toll样受体(TLR)-2、白介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;苏木精—伊红(HE)染色法测定脑组织病理改变;实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及免疫印迹法(Western blotting)测定大鼠脑组织TLR4、MyD88、TRIF mRNA及蛋白水平。结果:与缺血性脑卒中模型组比较,薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平,脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA及蛋白水平均明显降低(均P<0.05),90 s内穿越平台次数显著增加(P<0.05),大鼠脑组织病理性变化明显恢复,且各项指标变化与薯蓣皂苷元的剂量表现出依赖性。结论:薯蓣皂苷元能够修复缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及神经损伤,抑制脑组织炎症反应,其机制可能与调节TLR4-MyD88/TRIF信号通路有关。

脂多糖通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞激活模型的建立

目的探讨不同活化程度的BV2小胶质细胞与炎性介质之间的关系及可能的细胞信号转导途径,建立高效稳定的BV2小胶质细胞激活模型。方法体外常规培养BV2小胶质细胞,CCK-8法绘制细胞生长曲线;采用不同浓度的脂多糖(LPS)(0.25、0.5、1、2、4μg/mL)诱导BV2小胶质细胞24 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;应用CCK-8法和Griess法分别检测细胞活性和一氧化氮(NO)水平;应用蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)蛋白和mRNA的表达。同时选取浓度为1μg/mL的LPS诱导BV2小胶质细胞24 h,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)浓度。结果 CCK-8法和Griess法结果显示:BV2小胶质细胞传代培养后第2~3天处于对数生长期;LPS能明显降低BV2小胶质细胞存活率及提高NO释放量(均P<0.05),且在实验剂量范围内呈现剂量-效应关系。Western blot和qRT-PCR结果显示:TLR4、MyD88 mRNA及蛋白的表达随着LPS浓度增加呈现先升高后降低的趋势,且均在LPS为1μg/mL时达到峰值(均P<0.05)。ELISA结果显示:LPS(1μg/mL)显著提高TNF-α和IL-1β浓度,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 LPS可能通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞活化,进而上调其炎性介质的水平;1μg/mL LPS是建立高效稳定BV2小胶质细胞激活模型的最佳浓度。

卡维地洛对肝纤维化动物模型TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响及其抗肝纤维化的作用机制

目的探讨卡维地洛对肝纤维化动物模型TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响及其抗肝纤维化的作用机制。方法将60只SD大鼠作为研究对象,随机分为空白对照组、模型组以及低、中、高剂量卡维地洛组,每组各12只。采用胆总管结扎法建立模型组和卡维地洛组大鼠的肝纤维化模型,并于造模成功后48 h开始,低、中、高剂量卡维地洛组每天分别灌胃给药药液0.5、1.0、1.5 mg/kg;空白对照组和模型组灌胃等量蒸馏水。干预4 w后比较各组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)水平、炎症因子[白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平以及肝纤维化血清指标[羟脯氨酸(Hyp)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原肽(PIIINP)]水平。并取出每组大鼠的肝脏左叶组织进行切片,采用常规HE染色和Masson三色染色后于显微镜下观察对比肝脏纤维化程度;采用Westernblot法检测各组大鼠肝组织中NF-κB与TLR4/MyD88蛋白表达水平;采用实时定量PCR法检测NF-κB与TLR4/MyD88 mRNA水平。结果HE及Masson三色染色结果显示模型组大鼠肝纤维模型造模成功,与空白对照组比较,模型组IL-1、IL-6、TNF-α、ALT、AST以及Hyp、LN、PIIINP水平明显升高(P<0.05),ALB水平水平明显下降(P<0.05);干预4 w后,低、中、高剂量卡维地洛组大鼠血清ALT、AST、炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平以及Hyp、LN、PIIINP相比模型组明显下降(P<0.05),ALB水平明显上升(P<0.05),且随着给药剂量增加,各因子水平改善更显著。模型组大鼠TLR4、MyD88和NF-κB蛋白及mRNA表达水平相比空白对照组明显升高(P<0.05)。不同剂量卡维地洛干预后,随着剂量增加,TLR4、MyD88和NF-κB蛋白及mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论卡维地洛可能通过调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路调控TLR4、MyD88以及NF-κB蛋白表达,发挥抑制肝脏炎症反应和抗纤维作用,从而改善肝纤维化程度。

哮喘丸抑制顽固性咳嗽及其对TLR4-MyD88-NF-κBp65信号通路的调控作用

目的:咳嗽变异性哮喘是顽固性咳嗽的主要病因。观察哮喘丸对咳嗽变异性哮喘大鼠的治疗效果,并进一步探讨其作用机制。方法:选用4%鸡蛋清白蛋白和2%的Al(OH)3共同致敏大鼠,建立咳嗽变异性哮喘大鼠模型。模型大鼠分别灌胃给予低、中、高剂量(0.9,1.8,3.6 g/kg)哮喘丸或孟鲁司特钠,每天1次,连续14 d,并于干预7,14 d后从各组分别随机取5,10只大鼠用于采集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和气管、肺组织。对BALF中的白细胞及嗜酸性粒细胞计数;采用ELISA试剂盒检测各组大鼠BALF中IFN-γ,IL-1β,TNF-α的水平;对各组大鼠肺组织行病理学检查,观察其组织形态学变化;采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肺组织中TLR4,MyD88,NF-κBp65和p-p65的蛋白质表达。结果:哮喘丸能明显减少变异性哮喘模型大鼠BALF中白细胞及嗜酸性粒细胞的数目(P<0.05或P<0.01),并能改善气管及支气管黏膜上皮增生和肺组织炎症细胞浸润程度;干预14 d,与模型对照组比较,哮喘丸高剂量组IFN-γ水平明显升高(P<0.01),IL-1β和TNF-α水平明显降低(均P<0.05),大鼠肺组织TLR4,MyD88,p-p65及p65的蛋白质表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:哮喘丸对大鼠顽固性咳嗽具有治疗作用,其作用机制可能与调控气道TLR4-MyD88-NF-κBp65信号通路,调节炎症和免疫反应有关。

去泛素化酶7与髓样分化因子88蛋白相互作用的研究

Toll-like受体(TLRs)介导的信号途径不仅参与机体识别病原微生物入侵、诱导免疫应答,而且还可诱导机体产生破坏性炎症反应.通过免疫共沉淀、免疫荧光共定位、间接免疫荧光等实验方法鉴定去泛素化酶7(USP7)和TLR信号途径中重要接头蛋白——髓样分化因子88(MyD88)的相互作用,结果表明USP7和MyD88可在细胞质中共定位并可发生相互作用.该研究对阐释TLR信号通路的机制奠定了重要的基础.

异氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带TLR4-MyD88信号通路的影响

目的探讨异氟醚预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带TLR4-MyD88信号通路的影响。方法成年雄性SD大鼠54只，体重250～280g，采用随机数字表法，将其随机分为3组（n=18）：假手术组（S组）、脑缺血再灌注组（I／R组）和异氟醚预处理组（1P组）。S组仅分离血管不留置线栓；I／R组采用线栓法制备右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2h，再灌注24h；IP组吸入2．0％异氟醚2h，预处理结束后24h时制备右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注24h时行神经功能缺陷评分，随后处死大鼠，每组随机抽取5只大鼠，取脑组织，测定脑梗死体积，采用Westernblot法和RT—PCR法检测大鼠右侧脑缺血半暗带区HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA的表达情况；每组剩余的3只大鼠，采用TUNEL法检测大鼠右侧脑缺血半暗带区细胞凋亡情况。结果与S组比较，I／R组和IP组神经功能缺陷评分升高，脑梗死体积增大，右侧脑缺血半暗带区凋亡指数升高，HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达均上调（P〈0．05）；与I／R组比较，IP组神经功能缺陷评分降低，脑梗死体积减小，右侧脑缺血半暗带区凋亡指数降低，HSP60、TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达均下调（P〈0．05）。结论异氟醚预处理可保护脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带，其机制可能与抑制大鼠脑缺血半暗带TLR4-MyDg8信号通路有关。

麻杏石甘汤对流感病毒肺部感染模型肺组织TLR2/4-MyD88信号通路蛋白表达的影响

目的:从肺组织TLR2/4-MyD88信号通路蛋白表达水平探索麻杏石甘汤抗流感病毒效应机制。方法:经鼻腔接种建立流感病毒肺部感染模型,设正常对照组、模型对照组、奥司他韦组、抗病毒口服液组、麻杏石甘汤组。各治疗组经灌胃给药3、7 d,常规法检测肺指数、肺指数抑制率;HE染色法观察肺组织的病理变化;免疫组织化学法和免疫印迹法检测肺组织TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。结果:与正常对照组比较,模型对照组肺指数显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,给药治疗3 d的麻杏石甘汤组肺指数显著降低(P<0.05)。与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织充血水肿,大量炎症细胞浸润;与模型对照组比较,给药治疗3、7 d的麻杏石甘汤组小鼠肺组织病理损伤得到明显改善。免疫组化结果显示:给药3 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织内TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著下降(P<0.05);给药7 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织内MyD88蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织内MyD88蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。免疫印迹法显示:给药3 d,与正常对照组比较,模型对照组肺组织内TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,麻杏石甘汤组肺组织各蛋白表达水平显著降低(P<0.05);给药7 d,各组间差异无统计学意义。结论:麻杏石甘汤可能是通过调节TLR2/4-MyD88信号通路相关蛋白的表达水平而发挥抗流感病毒作用。

β-淀粉样蛋白1-42寡聚体对BV2小胶质细胞炎症反应的影响及机制研究

目的:探讨β-淀粉样蛋白1-42寡聚体(amyloidβ-protein 1-42 oligomer,oAβ)对BV2小胶质细胞炎症反应的影响及可能的机制。方法:制备oAβ,采用不同浓度(0、0.5、1、5、10、20μmol/L)的oAβ孵育BV2小胶质细胞24 h后,用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;用CCK-8法检测BV2小胶质细胞活力;用ELISA法检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-4和IL-10的分泌水平。随后将BV2小胶质细胞分成对照组、模型组和拮抗剂组,模型组选取浓度为5μmol/L的oAβ处理BV2小胶质细胞,拮抗剂组在模型组基础上加10μmol/L Toll样受体1(Toll-like receptor 1,TLR1)/TLR2拮抗剂CU-CPT22作用于细胞,应用RT-qPCR和Western blot检测3组细胞TLR1、TLR2、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的mRNA和蛋白表达,用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10的分泌水平。结果:BV2小胶质细胞的活力随着oAβ浓度的增加而降低,TNF-α和IL-6分泌水平随oAβ浓度的增加而升高,IL-4和IL-10分泌水平随oAβ浓度的增加而降低,且与0μmol/L oAβ组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,模型组TLR1、TLR2和MyD88的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.01),TNF-α和IL-6分泌水平显著升高(P<0.01),IL-4和IL-10分泌水平显著降低(P<0.01);与模型组相比,拮抗剂组TLR1、TLR2及MyD88 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05),TNF-α和IL-6分泌水平显著降低(P<0.01),IL-4和IL-10分泌水平无显著变化(P>0.05)。结论:不同浓度的oAβ刺激BV2小胶质细胞后均出现了炎症反应,且oAβ呈浓度依赖性的升高了促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平,降低了抗炎细胞因子IL-4和IL-10的表达水平;oAβ可能通过TLR1/2-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞活化,进而上调其促炎介质的水平。

银花平感颗粒的体外抗甲型H1N1流感病毒作用

目的探讨银花平感颗粒体外抗甲型A/PR8/34(H1N1)流感病毒的作用机制。方法采用MTT比色法测定药物对巨噬细胞的最大无毒浓度(TC_0),半数细胞毒性浓度(TC_(50))及药物不同给药方式的抗病毒有效率,采用Probit回归分析计算其对病毒感染的半数抑制浓度(IC_(50))及治疗指数(TI);流感病毒H1N1感染培养的RAW264.7细胞,用利巴韦林(62.5μg/ml),银花平感颗粒高(500μg/ml)、中(250μg/ml)、低(125μg/ml)各剂量进行干预,4、16、24 h后收集细胞,实时荧光定量PCR法观察各组细胞中Toll样受体7(TLR7)、髓样分化因子88(My D88)、核因子p65(NF-κB p65)、干扰素调节因子7(IRF7)的变化。结果银花平感颗粒在31.25~500μg/ml范围内可降低流感病毒复制,其中药物治疗组在给药24 h后,抗病毒有效率最高;与正常对照组同时间比较,模型对照组TLR7、My D88、IRF7、NF-κB p65 mRNA表达水平均显著升高,且16 h达最高峰,较本组4 h、24 h差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);经药物干预后,银花平感颗粒高、中剂量组及利巴韦林组均显著下调流感病毒诱导4、16、24 h后的TLR7、My D88、IRF7和NF-κB p65 mRNA表达水平(P<0.05或P<0.01),尤以银花平感颗粒高剂量组对TLR7、My D88和NF-κB p65 mRNA表达水平的下调作用较利巴韦林组更为显著(P<0.05)。结论银花平感颗粒体外可明显抑制流感病毒复制,主要是通过治疗给药而发挥抗病毒作用,其抗病毒效果可能与其抑制TLR7/My D88/IRF7信号通路及NF-κB p65的激活有关,且高剂量对流感的治疗效果优于利巴韦林。