树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

背景:成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎病变过程中发挥着重要的作用,当炎症性关节炎发生时滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞会大量增殖,释放炎症因子能引起关节炎症和软骨的损伤。目的:建立树鼩膝关节成纤维样滑膜细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法,并探讨其生物学特性;建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子的检测方法,初探TLR8通路在细胞中的活化情况。方法:利用组织块贴壁法和连续传代法分离、纯化树鼩成纤维样滑膜细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,苏木精-伊红染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色法检测成纤维样滑膜细胞的标志性蛋白(波形蛋白)的表达。经人TLR8配体R848刺激前后,采用Western blot方法检测树鼩成纤维样滑膜细胞与人成纤维样滑膜细胞中TLR8及其信号通路蛋白的表达,采用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8通路及其下游基因mRNA的表达。结果与结论:①倒置显微镜下可见,经过3代的传代培养后,树鼩成纤维样滑膜细胞多为梭形,大小相近,纯度高,在体外生长增殖状况良好;苏木精-伊红染色显示细胞形态多呈梭形,大小相近;免疫细胞化学染色显示,成纤维样滑膜细胞胞浆波形蛋白表达阳性;CCK-8实验结果显示,树鼩成纤维样滑膜细胞生长曲线为“S”型;②Western blot检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中的核因子κB蛋白表达升高(P<0.05),p-P38蛋白表达降低(P<0.05),TLR8、MyD88、P38、p-Erk1/2、和RANKL蛋白表达无明显变化(P>0.05);人成纤维样滑膜细胞中的p-P38蛋白表达降低(P<0.05),TLR7、TLR8、MyD88、核因子kB、P38、p-Erk1/2和RANKL蛋白表达无明显变化(P>0.05);③RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、干扰素β、TLR9-2、TLR9-1、TLR8-2、TLR8-1、TLR7-2、TLR7-1 mRNA表达无明显变化(P>0.05);④结果表明,采用组织贴壁法可分离树鼩成纤维样滑膜细胞,利用人来源抗体可建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子检测方法。

肝癌细胞外泌体诱导肝癌细胞炎症因子的表达

目的探讨肝癌细胞HepG2和SMMC-7721外泌体对同源细胞HepG2和SMMC-7721的TLR8信号通路及细胞因子的调节作用。方法利用SBI试剂盒收集肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721外泌体,利用透射电镜和Western blot检测鉴定外泌体的形态和标志蛋白的表达。利用CCK-8法检测外泌体对细胞增殖活性的影响。利用荧光定量PCR和Western blot检测TLR8、MyD88、NF-κB的表达。利用ELISA法测定培养液上清中细胞因子TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ质量浓度的变化。结果与空白对照组相比,肝癌细胞HepG2和SMMC-7721外泌体对细胞的增殖活性没有引起显著性变化(P>0.05)。荧光定量PCR和Western blot结果显示外泌体作用后,TLR8、MyD88、NF-κB的m RNA表达量和蛋白质量浓度明显增多(P<0.05)。ELISA结果显示外泌体作用后细胞因子TNF-α、IL-12、IL-6和IFN-γ的分泌也有显著性增加(P<0.05)。结论肝癌细胞来源的外泌体可调节肝癌细胞的炎症反应。