重组结核分枝杆菌CFP10蛋白对A549细胞TLR信号途径介导的炎症反应的影响

本研究旨在检测重组结核分枝杆菌10 ku培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10, CFP10)对肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞Toll样受体(TLRs)信号途径及其介导的炎症反应的影响。PCR扩增cfp10目的基因片段,构建重组质粒载体pCzn1-CFP10。将重组质粒pCzn1-CFP10转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白CFP10(rCFP10)并鉴定,纯化rCFP10,去除内毒素及脱盐备用。设置对照组,利用MTT检测rCFP10对A549细胞的存活率的影响;通过qRT-PCR、Western blot及ELISA等技术,分别在转录和翻译水平检测rCFP10对A549细胞TLRs信号途径关键分子及其下游炎症因子表达的影响。结果显示,成功构建重组表达载体pCzn1-CFP10并表达纯化出高纯度的rCFP10。MTT结果显示,随着rCFP10浓度增加和处理时间延长,A549细胞存活率显著降低。与空白对照组相比,rCFP10分别从转录和翻译水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调A549细胞中TLRs途径关键分子TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平。rCFP10蛋白可以通过激活A549细胞TLRs受体信号途径促进细胞炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。

LPS/TLR4信号途径在非酒精性脂肪性肝病中的作用

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号途径参与非酒精性脂肪性肝病的发生发展,非酒精性脂肪性肝病肝脏中LPS受体TLR4表达上调,诱导炎症反应,促使肝细胞损伤.非酒精性脂肪性肝病时肠道菌群失调,LPS产生增多,肠壁通透性增强,形成肠源性内毒素血症,LPS上调Kupffer细胞TLR4的表达,分别通过MyD88-依赖途径和MyD88-不依赖途径,最终激活核因子B,诱导强力的炎症反应,从而介导肝损伤.本文就LPS/TLR4信号途径的构成、调节方式及与非酒精性脂肪性肝病的关系做一综述.

Hsp70在TLR信号途径中对肿瘤细胞增殖的影响

目的:研究Hsp70在TLR信号途径中对肿瘤细胞增殖的影响。方法:将体外培养的H22细胞分成对照组和用Hsp70刺激的实验组,设计基因表达的引物、PCR扩增、RT-PCR检测两组细胞的TLR2和TLR4的mRNA表达水平,Western blot检测β-catenin水平,对培养10天后的H22细胞进行计数。结果:Hsp70分别处理H22细胞8h后,基因TLR2、TLR4mRNA的表达均明显上调;Hsp70促进H22细胞中β-catenin上调表达;Hsp70处理组的细胞增殖倍数高于对照组。结论:Hsp70在TLR信号途径中具有促进肿瘤细胞增殖作用。

基于高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4信号途径研究慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉发病过程中炎性因子的表达

目的探讨基于高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号研究慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyp,CRSwNP)发病过程中炎性因子的表达。方法HE检测CRSwNP中的嗜酸细胞;免疫组织化学、qRT-PCR和Western blot检测CRSwNP中HMGB1的表达;qRT-PCR检测CRSwNP中IL-4和IL-13的表达;ELISA检测HMGB1(HMGB1/TLR4通路)对人鼻黏膜上皮细胞中IL-4和IL-13表达的影响。结果CRSwNP中嗜酸细胞浸润增加(P<0.001),HMGB1表达上调(P<0.001),IL-4 mRNA和IL-13 mRNA的表达增加(P均<0.01);HMGB1使人鼻黏膜上皮细胞中IL-4和IL-13的表达增加(P均<0.001);与HMGB1(100 ng/ml)孵育组比较,加入抗TLR4抗体孵育后人鼻黏膜上皮细胞中IL-4和IL-13的表达水平降低(P均<0.001)。结论CRSwNP组织中HMGB1高表达。脂多糖刺激人鼻黏膜上皮细胞中HMGB1的产生,进而通过TLR4上调人鼻黏膜上皮细胞中IL-4和IL-13的产生。

Arl8a与树突状细胞TLR4-TRIF信号途径的相关性

目的 探讨ADP-核糖基化因子样8A（ADP-ribosylation factor-like 8A,Arl8a）与树突状细胞（dendritic cell,DC）中TLR4-TRIF-GEFH1-RhoB信号途径的相关性.方法 从野生型和TRIF敲除基因（TRIFKO）小鼠中分离和培养DC,LPS刺激后收集细胞扩增总cDNA,通过实时定量PCR检测Arl8a的mRNA表达.然后用鸟嘌呤核苷酸交换因子H1（GEFH1）的siRNA转染来自野生型小鼠的DC,进行LPS刺激或未刺激处理并检测Arl8a的mRNA表达.再用GEFH1和Arl8a的siRNA转染DC,LPS刺激后检测RhoB的mRNA表达.结果 在LPS刺激后,Arl8a的mRNA表达在野生型小鼠的DC中增加,在TRIFKO小鼠的DC中则未被上调.此外,在野生型小鼠中Arl8a的mRNA上调可被GEFH1的siRNA明显抑制（P＜0.01）.而Arl8a和GEFH1的siRNA均能显著抑制RhoB的mRNA表达（P＜0.01）.结论 Arl8a的表达与DC的TRL4-TRIF途径有关,并且在转录水平与GEFH1和RhoB相关.

Arl8a与树突状细胞TLR4两条下游途径的相关性

为探讨Arl8a(ADP-ribosylation factor-like 8A)与树突状细胞(dendritic cells,DCs)TLR4两条下游信号途径的关系,用Arl8a和GEFH1(guanine nucleotide-exchange factors H1)的siRNA转染来自野生型小鼠的DC,进行LPS刺激或未刺激处理后,检测TLR4-TRIF途径中RhoB靶蛋白MYH9的mRNA表达。然后从野生型和IFNα/β受体基因敲除小鼠中分离和培养DC,LPS刺激后收集细胞扩增总cDNA,通过实时定量PCR检测Arl8a的mRNA表达。再用Arl8a的siRNA转染DC,LPS刺激后检测IL-6和IL-12a的mRNA表达。结果表明,Arl8a和GEFH1的siRNA均能显著抑制LPS介导的MYH9的mRNA表达(P<0.01),而且在LPS刺激后,Arl8a的mRNA表达在野生型小鼠的DC中增加,在IFNα/β受体基因敲除小鼠的DC中则未被上调。此外,Arl8a的siRNA对IL-6和IL-12a的mRNA表达没有显著效应。以上结果提示,在转录水平,Arl8a和GEFH1均对MYH9的表达有影响,并且Arl8a基因的表达与TRIF-IFNβ途径有关,Arl8a可能与MyD88途径中细胞因子IL-6和IL-12a的表达无关。

重组CFP10-ESAT6蛋白通过TLR信号介导A549细胞抗BCG感染

本研究旨在探究重组CFP10-ESAT6蛋白在结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染肺泡上皮细胞过程中对肺泡上皮细胞TLR信号途径及其介导的炎症反应的影响。利用原核表达系统表达纯化Mtb重组蛋白CFP10-ESAT6,使用重组蛋白处理A549细胞,利用CCK-8试剂盒检测重组CFP10-ESAT6对细胞活性的影响;使用重组CFP10-ESAT6和减毒牛分支杆菌BCG处理细胞并设置相应组别,提取细胞总RNA和总蛋白,利用qRT-PCR技术、Western-blot及ELISA方法分别从转录和翻译水平检测A549细胞中TLR信号途径关键分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,成功获得高纯度的重组CFP10-ESAT6,并且重组CFP10-ESAT6在一定浓度范围和处理时间条件下能够降低A549细胞的存活率。当BCG或重组CFP10-ESAT6单独处理A549细胞时,细胞中TLR2、TLR4、My D88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,重组CFP10-ESAT6与BCG共处理时,重组CFP10-ESAT6显著(P<0.05)降低了由BCG刺激所导致的TLR途径关键分子TLR2、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、IL-6及TNF-α等炎症因子的表达水平。上述结果表明,重组CFP10-ESAT6可以减轻A549细胞在抗Mtb感染过程中由TLR信号介导的炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。

D-半乳糖与L-谷氨酸诱导树鼩肝组织损伤

目的探究D-半乳糖与L-谷氨酸对树鼩肝组织损伤及机制。方法雄性树鼩随机分为4组:对照组(CT组)、D-半乳糖组(D组)、L-谷氨酸组(G组)、D-半乳糖组+L-谷氨酸组(D+G组),每周称量体重、计算存活率。给药8周后,心脏采血处死树鼩,4%多聚甲醛灌注固定肝,进行HE和免疫组织化学染色,检测TLR2、NF-κB和P-gp表达。结果相对于第1周,第8周D+G组树鼩体重下降。G组、D组、D+G组生存率下降,肝细胞变性、水肿、坏死、炎性细胞浸润、中央静脉、门静脉、分支胆管扩张,其中D+G组最严重。相对于CT组,D组、G组和D+G组的TLR2(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和P-gp(P<0.01)表达均升高;在3个处理组中,D+G组的TLR2(P<0.05)、NF-κB(P<0.01)和P-gp(P<0.01)表达显著高于D组和G组。结论D-半乳糖、L-谷氨酸单独或联合给药均可引起树鼩肝组织损伤,联合给药损伤更严重。其机制可能涉及TLR2/NF-κB通路激活,同时P-糖蛋白代偿性增加。

GEFH1在LPS诱导树突细胞IL-6和IL-12a表达中的作用

为探讨GEFH1与树突细胞(dendritic cell,DC)TLR4两条下游信号途径的关系,从野生型和TRIF基因、IFNα/β受体基因敲除小鼠中分离和培养DC,LPS或IL-6刺激后收集细胞制备总cDNA,通过实时定量PCR检测GEFH1的mRNA表达。再用GEFH1的siRNA转染DC,LPS刺激后检测IL-6和IL-12a的mRNA表达。结果,在LPS刺激后,GEFH1的mRNA表达在野生型小鼠的DC中显著增加,在TRIF基因、IFN-α/β受体基因敲除小鼠的DC中则未被上调。此外,GEFH1siRNA处理后,IL-6和IL-12a的mRNA表达均上升显著(P>0.05),而在IL-6刺激的野生型小鼠的DC中,GEFH1的mRNA没有明显改变。以上结果提示在转录水平,TRIF-IFNβ信号通路、而非IL-6可诱导GEFH1基因表达。GEFH1可能对MyD88途径中细胞因子IL-6和IL-12a的表达有负调节作用。

有氧运动可提高脑缺血大鼠的神经功能和认知功能

为了揭示有氧运动对脑缺血大鼠神经功能和认知功能的改善作用机制,本研究建立了大鼠中脑动脉闭塞手术(MCAO)诱导缺血性中风大鼠模型。将大鼠在跑步机上以10 m/min的速度运动30 min,每天运动1次,共运动4周。用2,3,5-三苯四唑氯化物(TTC)染色评估MCAO手术是否成功建立。通过神经功能缺损评分来考察大鼠的神经功能、Morris水迷宫实验考察大鼠的认知功能、免疫荧光染色检测大鼠脑缺血半影区中的神经发生和血管生成。此外,通过蛋白质印迹法测定缺血半影区中的TLR4、p-NF-κBp65、NF-κBp65、NLRP3和IL-1β的蛋白水平。结果表明,有氧运动不仅降低了大鼠的脑梗死面积和神经功能缺损评分(p<0.05),还降低了大鼠的逃避潜伏期,提高了穿越平台次数(p<0.01)及增加了缺血性中风后新生神经元的数量和脑微血管密度(p<0.05)。此外,有氧运动下调了大鼠脑缺血半影区中TLR4、p-NF-κBp65、NF-κBp65、NLRP3和IL-1β的蛋白水平(p<0.05)。研究发现,有氧运动可抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号传导途径来促进大鼠脑缺血半影区的神经发生和血管生成,从而提高脑缺血大鼠的神经功能和认知功能。

Stathmin mRNA在树突状细胞中的表达及其意义

目的探讨StathminmRNA在树突状细胞中的表达及其意义。方法分离和培养小鼠的树突状细胞,用细菌脂多糖(LPS)刺激0h、3h、12h后,收集细胞,并提取细胞总RNA,经RT-PCR反转录为cDNA,再通过荧光定量实时PCR检测Stathmin的mRNA水平。结果定量PCR标准曲线的相关系数为-0.99,且融解曲线峰单一,表明已成功建立了准确、特异的实时定量PCR方法。经LPS刺激后,树突状细胞Stathmin的mRNA表达水平降低,随时间的延长而递减(P<0.01)。结论树突状细胞的Toll样受体4信号途径与Stathmin的表达相关。