白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响

目的分析白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响。方法于SD大鼠右侧踝关节处注入200μL尿酸钠溶液以构建AGA模型,本研究中最终成功构建40只AGA大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、低剂量组(0.265 g/100 g)、中剂量组(0.53 g/100 g)、高剂量组(1.06 g/100 g),每组各10只,并纳入10只健康SD大鼠为对照组,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别灌胃不同剂量的白虎加桂枝汤,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,各组均连续灌胃7 d,并标准饲养。比较各组大鼠不同时刻踝关节周长、尿酸、血肌酐、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、步态评分和滑膜组织中NALP3、TLRs相关蛋白及其mRNA表达水平。结果灌胃1、3、7 d时对照组大鼠的踝关节周长、尿酸、血肌酐、IL-1β、TNF-α水平、步态评分最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。灌胃1、3、7 d时对照组大鼠滑膜组织中NALP3、TLR3、TLR7蛋白表达及其mRNA表达最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。结论白虎加桂枝汤能够改善AGA大鼠的炎症反应,改善肾功能,减轻踝关节组织病理损伤,其机制可能与抑制TLRs和NALP3信号通路相关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉性心脏病小鼠心肌保护作用

目的 研究基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)小鼠心肌保护作用。方法 50只6周的雄性SD小鼠中取10只作正常对照组,其余小鼠给予高脂饮食建立CHD模型。采用随机数字表法将40只模型小鼠分为模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,每组各10只。黄连解毒汤低、中、高剂量组每日分别以10、20、40 g/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组每日给予等量蒸馏水灌胃。干预后采用生化法检测各组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、内皮素水平;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠心肌细胞病理形态,蛋白质印迹法检测心肌组织中TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。比较各组小鼠血脂、心肌组织中抗氧化相关指标和TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。结果 模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组血脂水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低剂量组与模型组血脂水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);黄连解毒汤中、高剂量组总胆固醇、甘油三酯、LDL水平均低于模型组,HDL水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组心肌组织中SOD水平均低于对照组,丙二醛、内皮素水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组SOD水平均高于模型组,丙二醛、内皮素水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌纤维排列整齐,横纹清晰且细胞完整,无细胞肿胀、炎症浸润等;模型组心肌纤维排列紊乱,结构发生异常,有严重细胞肿胀、炎症浸润;黄连解毒汤低、中、高剂量组未见心肌纤维断裂,黄连解毒汤中、高剂量组细胞肿胀和炎症浸润情况优于黄连解毒汤低剂量组,黄连解毒汤高剂量组优于黄连解毒汤中剂量组。模型组、黄连解毒汤中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。且黄连解毒汤各剂量组中以上指标变化呈剂量依赖性。结论 黄连解毒汤能降低CHD小鼠血脂水平,保护心肌细胞,其能够通过下调组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达以调节血脂水平并改善心肌功能,且黄连解毒汤的效果随着剂量的增加而增强。

TLR4/miR-223/NLRP3信号通路的表达与脑卒中后抑郁大鼠海马炎症反应的关系

目的探究Toll样受体4(TLR4)/miR-223/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的表达与脑卒中后抑郁(PSD)大鼠海马炎症反应的关系。方法30只3月龄SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组,PSD模型组和TLR4抑制剂组,各10只。PSD模型组和TLR4抑制剂组建立PSD模型,TLR4抑制剂组给予0.3 mg/kg的TAK-242溶液腹腔注射,其余各组均腹腔注射等体积的生理盐水溶液,5次/周,连续4周。评定各组大鼠的神经行为学,ELISA法检测血清白介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达水平,RT-PCR测定海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3信号通路相关基因的表达,Western blot测定TLR4/miR-223/NLRP3信号轴蛋白的相对表达。结果与假手术组相比,PSD模型组和TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达升高,糖水偏嗜比(SP)、移动情况(LA)显著降低(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达表达下降、LA和SP升高(P<0.05)。与假手术组相比,PSD模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA、miR-223和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达均显著升高(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组的TLR4 mRNA和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达显著降低,miR-223的表达显著升高(P<0.05)。结论TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路与PSD海马炎症反应密切相关,通过调控TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路可能成为临床防治PSD的新靶位和新思路。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响。方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、依那普利(10 mg/kg)组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),每组12只。除假手术组外,其余5组建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,各组灌胃给予相应药物,每天1次,连续给药2周。全自动生化分析仪检测大鼠血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平,Masson染色观察大鼠肾组织病理学变化,试剂盒检测大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)阳性表达,Western blot法检测大鼠肾组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肾组织可见肾小管扩张,上皮细胞出现部分空泡化,肾间质内大量炎性细胞浸润、纤维细胞生成及胶原纤维沉积,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平、肾组织TGF-β1阳性表达、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达降低(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷B2各剂量组大鼠肾脏病变逐渐减轻,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平,肾组织TGF-β1阳性表达,TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达均升高(P<0.05);与柴胡皂苷B2高剂量组比较,依那普利组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论柴胡皂苷B2能够缓解UUO大鼠肾间质纤维化,改善肾功能和炎症反应,可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的表达有关。

积雪草酸通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路改善非酒精性脂肪肝的机制研究

探究天然活性成分积雪草酸(asiatic acid,AA)对高脂饮食导致的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的改善作用及机制。取雄性C57BL/6J小鼠40只,分为正常组、模型组、AA低剂量组、AA高剂量组,高脂饮食4周后给予AA干预,持续12周;实验结束后,称量肝脏重量并计算肝脏指数;通过分光光度法测定小鼠血清中脂肪肝相关生化指标的含量;通过酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测小鼠血清中相关炎症因子的表达水平;通过免疫印记法检测小鼠肝脏中TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达;通过多种染色法观察小鼠肝脏病理学变化。结果显示:AA可以有效改善NAFLD小鼠的一般指标,生化指标、炎症因子及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达。AA可以通过下调TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制肝脏炎症,改善NAFLD。

芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠对老年慢性心力衰竭患者血清Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨芪苈强心胶囊辅助治疗老年CHF对患者Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:采用随机数表法将2021年3月至2023年3月平顶山市第一人民医院112例老年CHF患者分为采用沙库巴曲缬沙坦钠(诺欣妥)治疗的常规组(n=56例)和采用芪苈强心胶囊辅助治疗的联合组(n=56例)。观察两组疗效、心功能、血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)、Copeptin水平、Toll样受体(TLR4)、核因子-κ(NF-κB)水平及不良反应。结果:治疗3个月后,联合组的临床治疗总有效率、心输出量(CO)、左心室射血分数(LVEF)高于常规组(P<0.05);联合组TLR4、NF-κB、Gal-3、Copeptin水平低于常规组(P<0.05);两组患者用药期间不良反应发生率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠可调节TLR4、NF-κB水平,促进老年CHF患者心功能恢复,并抑制心肌重构,进而有效提高临床治疗疗效,且不增加患者不良反应发生风险。

miR-27a-3p介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用

目的分析miR-27a-3p介导Toll样受体(TLR)4/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用。方法选取80只SD级雄性大鼠,20只作为正常组,其余60只建立大鼠脑出血模型后随机分为模型组、上调组、下调组各20只,做miR-27a-3p转染,鉴定miR-27a-3p转染率、脑组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β含量、神经功能缺损情况、TLR4/TRIF信号通路蛋白表达情况。结果与模型组相比,上调组miR-27a-3p表达量升高,下调组miR-27a-3p表达量降低,具有统计学差异(P<0.05),证明miR-27a-3p转染成功。相比于正常组,模型组、上调组、下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,具有统计学差异(P<0.05);相比于模型组,下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,上调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量降低,具有统计学差异(P<0.05);且下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量高于上调组,具有统计学差异(P<0.05)。结论miR-27a-3p可介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经起到保护作用。减少大鼠脑内炎症反应。

绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的网络药理分析及基于TLR4/TRAF6/PI3KC3通路的协同抗炎作用

目的基于网络药理学和体外实验探究绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的机制。方法利用Swiss Target Prediction、PharmMapper、SEA和TCMSP数据库预测绿原酸和连翘苷的靶点,在GeneCards、OMIM、DRUGBANK和DisGeNET数据库获取细胞因子风暴的靶点,筛选交集靶点绘制Venn图,以STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络,采用DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞构建细胞因子风暴模型;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测巨噬细胞存活率;采用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)含量;以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TNF受体相关因子(TRAF4)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)蛋白表达。结果网络药理分析获得绿原酸联合连翘苷治疗细胞因子风暴的8个核心网络靶点[丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、低氧诱导因子1α(HIF1A)、IL-6、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、酪氨酸激酶(SRC)、Toll样受体4(TLR4)];富集关键通路包括PI3K/AKT信号通路等。体外实验结果显示,与对照组比较,模型组中NO、TNF-α、IL-6的释放量和iNOS、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.001)。与模型组比较,给药后NO、TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的水平均显著降低(P<0.001)。与单药给药组比较,绿原酸和连翘苷(1∶1)联合用药组炎症指标下降更明显(P<0.001)。与模型组比较,给药组TLR4、TRAF6、PI3K3C的蛋白表达和PI3K3C的磷酸化水平显著下降。结论绿原酸联合连翘苷能协同抑制促炎细胞因子的表达,调控细胞因子风暴,可能通过TLR4/TRAF6/PI3K3C信号通路实现。

阿替普酶联合红花提取物调节TLR4-NLRP3信号通路对大鼠急性脑梗塞的影响

目的:研究阿替普酶静脉溶栓联合红花提取物对急性脑梗塞的改善作用及潜在机制。方法:30只SD大鼠,随机选取6只作为假手术组,其余大鼠均构建急性脑梗塞模型。模型构建成功后,随机将造模大鼠分为模型组、阿替普酶组(尾静脉注射阿替普酶5mg/kg)、红花提取物组(尾静脉注射4g/kg)、阿替普酶联合红花提取物组,每组6只。各给药组大鼠给予相应干预,假手术组和模型组大鼠注射等体积的无菌0.9%氯化钠溶液,连续7d。通过Zea Longa进行神经功能缺损评分;TTC染色评价梗死面积;HE染色观察组织病理变化;伊文思蓝(Evans blue)含量测定;TUNEL法检测各组细胞凋亡;qRT-PCR检测脑组织TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达;Western blotting分析脑组织MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组Zea Longa评分显著升高,梗死面积显著增加,EB含量、细胞凋亡率、MMP-2、MMP-9、Bax、TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,阿替普酶联合红花提取物组能显著降低Zea Longa评分及梗死面积,EB含量、细胞凋亡率、MMP-2、MMP-9、Bax、TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:阿替普酶静脉溶栓联合红花提取物对急性脑梗塞大鼠具有保护作用,其通过抑制TLR4-NLRP3信号通路及减少细胞凋亡,从而改善急性脑梗塞受损的神经功能,是潜在疗法。

破血化瘀、填精补髓方对脑出血模型小鼠脑组织TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的影响

目的:探讨破血化瘀、填精补髓方治疗脑出血的相关作用机制。方法:野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠各90只,采用小鼠尾动脉取血向脑内灌注的方法建立脑出血小鼠模型,造模成功后120只小鼠随机分为野生型模型组、野生型方剂组、Nrf2基因敲除模型组、Nrf2基因敲除方剂组,每组30只。另分别取30只野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠脑内只插入微量注射针数分钟不注血作为野生型假手术组和Nrf2基因敲除假手术组。造模后对野生型方剂组及Nrf2基因敲除方剂组给予破血化瘀、填精补髓方10.41 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,模型组及假手术组给予等量生理盐水。给药1 d、3 d后检测小鼠的行为学变化及脑含水量变化,3 d后HE染色观察脑组织病理形态学改变,用Western Blot以及免疫组化检测脑组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白水平。结果:与野生型假手术组相比,野生型模型组小鼠的神经功能评分、脑含水量、HE染色病理细胞数、免疫组化阳性细胞数以及TLR4、NF-κB、NLRP3的蛋白表达水平均升高(P<0.05,P<0.01)。与野生型模型组比较,野生型方剂组小鼠上述各指标均明显改善(P<0.05)。相对于野生型模型组小鼠,Nrf2基因敲除型模型组小鼠上述各指标均有明显改善(P<0.05)。结论:破血化瘀、填精补髓方可以通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路抑制氧化反应及炎症反应,从而抑制脑出血后的神经细胞功能损伤,减少继发性脑损伤。

清热通络含药血清调控TLRs/NF-κB通路及NLRP3炎性体干预急性痛风性关节炎的机制研究

目的:探讨清热通络方含药血清通过TLR/NF-κB信号通路及NLRP3炎性体干预急性痛风性关节炎(AGA)的作用机制。方法:采用尿酸钠结晶(MSU)刺激外周血单个核细胞(PBMCs)建立急性痛风性关节炎模型,以TLRs抑制剂、清热通络方含药血清和生理盐水血清进行分组干预。ELISA法检测细胞上清中IL-1β、IL-8、IL-10的水平;Western Blot法检测TLR-2、TLR-4、NF-κB-P50、NF-κB-P65、IL-1β、MYD-88、NALP-3、Caspase-1蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组炎性因子IL-1β、IL-8、IL-10的分泌水平显著升高(P<0.05),通路及炎性体相关蛋白(TLR-2、TLR-4、NF-κB-P50、NF-κB-P65、IL-1β、MYD-88、NALP-3、Caspase-1)表达显著升高;与模型组比较,阳性药和清热通络含药血清中、高剂量显著下调炎性因子IL-1β、IL-8、IL-10的分泌(P<0.05),显著下调通路相关蛋白表达(P<0.05)。结论:清热通络方可能通过调控TLRs/NF-κB信号通路及抑制NLRP3炎症小体活化,抑制炎症因子的过度分泌,进而减轻痛风性炎症反应。

基于外泌体miRNA介导的TLR4/NLRP3信号通路探讨中医药治疗抑郁症的研究进展

抑郁症是目前影响全球3亿多人最普遍、致残率最高的精神疾病之一,主要表现为情绪低落、注意力不集中等。其发病机制十分复杂,目前尚未完全阐明,但已有研究表明神经炎症反应是抑郁症发生发展的关键病理机制,其中TLR4/NLRP3信号通路发挥关键作用。多种miRNA参与调控该炎症通路,与抑郁症发生关系密切,近年来成为国内外研究热点。文章就外泌体miRNA通过TLR4/NLRP3信号通路治疗抑郁症的研究进展进行综述,并列举部分通过该通路发挥抗抑郁作用的中医药,以期为临床上抑郁症的诊断和治疗提供新的方向。

肠愈宁对溃疡性结肠炎大鼠PI3K/AKT信号通路作用机制的研究

目的探讨肠愈宁方对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路中PTEN、TLR2、Caspase-3、Caspase-9蛋白的作用机制。方法将70只SPF级大鼠适应性喂养7天后分为空白组10只和造模组60只,造模组大鼠采用TNBS/乙醇溶液灌肠诱导UC模型。将成功建立模型的大鼠随机分为模型组,美沙拉嗪组,肠愈宁高、中、低剂量组、肠愈宁高、中、低剂量组分别灌服相当于生药量为4 g·mL^(-1)、2 g·mL^(-1)、1 g·mL^(-1)的肠愈宁方溶液10 mL·kg^(-1),美沙拉嗪组灌服相当于生药量为0.2 g·kg^(-1)美沙拉嗪悬浊液10 mL·kg^(-1),空白对照组、模型组给予等量10 mL·kg^(-1)生理盐水灌胃。各组大鼠灌胃均每天1次,连续14天。末次给药后处死大鼠取材。评估疾病活动指数,HE染色观察结肠变化,进行结肠组织损伤指数评分,蛋白免疫印迹法检测结肠组织PI3K、AKT、PTEN、TLR2、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组PI3K、AKT、Caspase-3、Caspase-9及TLR2蛋白表达水平增高(P<0.05),PTEN蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,肠愈宁高剂量组PI3K、AKT、Caspase-3、Caspase-9、TLR2蛋白表达水平均明显下降(P<0.05),PTEN蛋白表达水平显著升高(P<0.05);美沙拉嗪组、肠愈宁中剂量PI3K、AKT、Caspase-3水平均降低(P<0.05),PTEN蛋白表达水平升高(P<0.05),在Caspase-9中表达无统计学意义;肠愈宁低剂量组在各蛋白表达情况与模型组无统计学意义。结论肠愈宁方治疗UC作用显著,其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路及其相关蛋白PTEN、TLR2、Caspase-3、Caspase-9有关,能够有效缓解UC大鼠症状,减轻结肠病理损伤。

三硝基苯磺酸/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用

目的探讨三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用。方法雄性Wistar大鼠240只,随机分为正常对照组、模型组、电针组、TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)组、LY294002组和TLR4mAb-LY294002联合治疗(T&L)组。以TNBS/乙醇溶液灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎模型,电针组造模同时给予电针足三里穴治疗,TLR4mAb组给予TLR4mAb腹腔注射,LY294002组则予LY294002注射液腹腔注射,T&L组则同时给与上述TLR4mAb和LY294002腹腔注射,共4周,每日行疾病活动指数(DAI)评分。造模4周后处死大鼠取结肠组织标本,评价结肠黏膜损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI);免疫印迹法测定结肠黏膜磷酸化AKT(P-AKT)和活化NF-κB含量;RT-PCR法检测结肠组织中TLR4mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组结肠组织TLR4mRNA、PI3K mRNA、P-AKT、活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLR4mAb组TLR4mRNA表达显著下降(P<0.01),LY294002组PI3K mRNA、P-AKT表达显著下降(P<0.01),而在电针组和T&L组TLR4mRNA、PI3K mRNA及P-AKT表达均明显降低(P<0.01);与上述变化相对应,与模型组相比,各治疗组活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均明显降低(P<0.05或P<0.01),电针组和T&L组上述6指标优于TLR4mAb组和LY294002组,活化NF-κB与TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达呈正相关(r1=0.579,P<0.05;r2=0.561,P<0.05)。结论电针足三里穴能显著降低实验性溃疡性结肠炎大鼠的NF-κB活性及TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达,从而减轻结肠组织损害程度,这与其阻断TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路有密切关系。

TLR_4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用及其机制,为神经退行性疾病(ND)的发病机制与防治研究提供新的实验依据。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实验1设正常对照组、LPS组及TLR4抗体+LPS组;免疫荧光法检测P-P38,P-JNK的表达。实验2分为6组:正常对照组,LPS组,TLR4抗体+LPS组,SB202190(抑制P38)+LPS组,SP600125(抑制JNK)+LPS组,PD98059(抑制ERK)+LPS组;分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后再给以LPS刺激24 h,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Active-caspase-3的表达变化;流式细胞术检测海马神经元凋亡率。结果:LPS组海马神经元P-P38、P-JNK的表达明显高于正常对照组(P<0.01),TLR4抗体+LPS组P-P38,P-JNK表达显著低于LPS组(P<0.01)。与正常对照组相比,LPS组海马神经元Bcl-2/Bax表达减少、Active-caspase-3表达增加,海马神经元凋亡率增加(P<0.01)。而TLR4抗体+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组Bcl-2/Bax显著高于LPS组、Active caspase-3显著低于LPS组(P<0.01),海马神经元凋亡率显著低于LPS组(P<0.05,P<0.01)。PD98059+LPS组与LPS组海马神经元凋亡率无明显差异。结论:1海马神经元中有TLR4介导的P38/JNK信号通路。2海马神经元TLR4激活后,P-P38、P-JNK表达增加,使Bcl-2/Bax的比例降低和Active-caspase-3表达增加,从而促进海马神经元的凋亡。海马神经元凋亡过程中有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与。

白藜芦醇在PD小鼠模型中对TLR3/TRIF信号通路及脑内炎症微环境的影响

目的建立1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小鼠PD模型,探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对PD小鼠TLR3/TRIF信号通路及中脑黑质炎症微环境的影响。方法雄性C57/BL6小鼠30只,按照随机数字表法分为对照组、MPTP组和MPTP+Res组,每组各10只。对照组腹腔注射相同体积生理盐水;MPTP组腹腔注射生理盐水新鲜配制的MPTP 30mg/(kg·d),连续7d,结束注射7d后取材;MPTP+Res组:Res用乙醇溶解为50mg/mL,用PBS以1∶4的体积比进行稀释,连续注射MPTP 7d后,腹腔注射Res 28d,结束注射7d后取材。采用免疫组化及免疫荧光分别观察小鼠中脑黑质中多巴胺能神经元的变化及小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态。采用实时荧光定量PCR技术检测中脑黑质相关炎症因子mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质TH标记的多巴胺能神经元的数量及形态未发生明显变化;CD11b标记的小胶质细胞胞体相对变小,呈圆形及椭圆形,突起减少,变细、变长;而GFAP标记的星形胶质细胞胞体变小,胞体呈圆形,突起变短。qPCR实验结果表明:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质部位TLR3、IFN-β的mRNA表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),但TRIF的mRNA表达量未见明显变化,促炎因子iNOS、TNF-α的mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而抗炎因子Arg^(-1)的mRNA表达量明显增加。结论 Res可能通过抑制小胶质细胞及星形胶质细胞活化及激活TLR3/TRIF信号通路,降低中脑黑质的促炎因子的释放,从而改善MPTP诱导的小鼠PD模型中的炎症微环境。

疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究

目的:研究疏风宣肺方和解表清里方体外对人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路的影响。方法:利用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR3/7信号通路中基因转录的变化。采用荧光定量PCR和Western blotting法检测各组细胞中的Toll样受体3(Toll-like receptor3,TLR3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、激活核因子Kappa B(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)的mRNA及蛋白表达的变化。结果:在TLR3/7相关信号传导通路中,与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显上调,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组的TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),解表清里方对TLR3/7、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺组治疗效果优于解表清里组。Western blotting结果显示,H1N1感染组TLR3/7、NF-κB蛋白较正常组显著升高(P<0.05)。与H1N1感染组比较,两种方药的TLR3/7、NF-κB表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:疏风宣肺方和解表清里方可以抑制流感病毒H1N1所诱导的TLR3/7信号通路活化,下调活性NF-κB的转录活性,发挥抗流感病毒的作用。

人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对哮喘大鼠的抗炎作用机制

目的探讨人参皂苷Rb1介导Toll样受体(TLR)3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对哮喘大鼠模型抗炎作用的影响。方法80只SD大鼠随机分成5组:对照组、模型组、地塞米松组(1 mg/kg)、人参皂苷Rb1低剂量组(100 mg/kg)、人参皂苷Rb1高剂量组(200 mg/kg),每组16只。模型组、地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组建立哮喘大鼠模型,建模成功后地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组给予相应药物灌胃,对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃,每天1次,连续给药14 d。末次给药后24 h,测定大鼠血液淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、动脉血氧分压(PaO_(2))水平,计算大鼠肺/体比值,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法测定大鼠肺组织中TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平明显升高,PaO_(2)水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平降低,PaO_(2)水平升高(P<0.05);且人参皂苷Rb1高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平低于人参皂苷Rb1低剂量组,PaO_(2)水平高于人参皂苷Rb1低剂量组(P<0.05);与地塞米松组比较,人参皂苷Rb1低剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达升高,PaO_(2)水平降低(P<0.05);人参皂苷Rb1高剂量组与地塞米松组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论人参皂苷Rb1能够减轻哮喘模型大鼠肺部炎症反应,其机制可能与人参皂苷Rb1抑制哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平进而抑制TLR3/TRIF信号通路的激活有关。

姜黄素通过调控miR-29-3p和TLR4/NF-κB信号通路改善肾间质纤维化

为探究姜黄素通过调控miR-29-3p的表达和Toll样受体(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路发挥抗炎及抗纤维化的作用,通过转化生长因子β1(TGF-β1)诱导建立肾间质纤维化细胞模型,采用MTT法和流式细胞术分别测定姜黄素对细胞增殖活性和细胞凋亡率的影响,以酶联免疫吸附法(Elisa)和免疫印迹(WB)分别检测姜黄素和miR-29-3p mimic对人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)分泌水平的影响以及Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和NF-κB/TLR4信号通路相关蛋白的表达情况,用RT-PCR法检测miR-29-3、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)的表达水平。研究结果表明,与模型组相比,当姜黄素浓度为10μmol/L时可显著抑制TGF-β1诱导的肾间质纤维化细胞过度增殖,提高其凋亡率(P<0.05),抑制α-SMA(P<0.05)、COLⅠ(P<0.01)、COLⅢ(P<0.05)的生成,促进miR-29-3p的表达(P<0.01),抑制IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.01)的产生和p-IκBα/IκBα(P<0.01)、TLR4(P<0.05)、p-P65/p65(P<0.05)蛋白的相对表达量;在细胞转染实验中,与模型组相比,转染miR-29-3p mimic后细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.01),细胞中COL1A1和COL3A1的mRNA和α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、TLR4、p-IκBα/IκBα、p-P65/p65蛋白表达量显著下降(P<0.01)。研究表明,姜黄素具有抗炎和抗纤维化作用,能够改善肾间质纤维化,其机制与调控miR-29-3p和TLR4/NF-κB信号通路有关。

桔梗皂苷D对大鼠溃疡性结肠炎的改善作用及对TLR4/NOD信号通路蛋白表达的影响

【目的】探讨桔梗皂苷D对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及机制。【方法】将50只大鼠随机分为5组,包括正常组,模型组,桔梗皂苷D低、中、高剂量组,每组10只。除正常组大鼠给予蒸馏水饮用外,其他组大鼠通过在饮用水中施加5%硫酸葡萄糖钠(DSS)连续7 d诱导构建溃疡性结肠炎模型。实验第2~8周,桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠分别灌胃10、25、50 mg·kg^(-1)·d^(-1)桔梗皂苷D混悬液,正常组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水。给药期间,观察大鼠一般情况。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察结肠组织病理形态并进行组织学评分,Western Blot法检测结肠组织Toll样受体4(TLR4)/核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)通路相关蛋白TLR4、髓样分化因子88(MyD88)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达水平。【结果】(1)与正常组比较,模型组大鼠体质量、生存率、结肠长度和结肠质量均显著降低,疾病活动指数(DAI)评分显著升高(均P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠体质量、生存率、结肠长度和结肠质量均显著升高,DAI评分显著降低,其中,桔梗皂苷D中剂量组差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组结肠组织病理学评分升高(P<0.001);与模型组比较,桔梗皂苷D低、中、高剂量组结肠组织病理学评分均显著降低(P<0.05或P<0.01)。(3)与正常组比较,模型组中TLR4、MyD88和NLRP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,桔梗皂苷D中剂量组的TLR4、MyD88和NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】桔梗皂苷D可改善大鼠溃疡性结肠炎,其机制与通过TLR4/NOD信号通路缓解肠道炎症有关。