TM-TNF-α介导的反向信号下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达

目的:观测TM-TNF-α介导的反向信号对sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的影响,构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变体,并进一步验证。方法:sTNF-α激活U937细胞后撤除,加入可溶性TNFR(sTNFRⅠ)激活TM-TNF-α介导的反向信号,用RT-PCR方法检测反向信号对活化后U937细胞因子IL-1β、IL-8mRNA的影响;采用分子克隆技术构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体,采用电穿孔法转染U937,并用Western blot检测蛋白表达。结果:sTNF-α激活U937细胞后撤除,高表达的细胞因子IL-1β、IL-8mRNA随着时间的延长而逐渐降低;sTNFRⅠ激活的TM-TNF-α介导的反向信号可加速细胞因子mRNA的降解,且使mRNA降解至50%的时间分别由约75、60分钟缩短至约45、35分钟。成功构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体pcDNA3.0-ΔcsTM-TNF-α并瞬时转染U937细胞,Western blot结果显示U937细胞膜表面除表达26000的野生型TM-TNF-α蛋白外,还可表达约20000的突变体蛋白。这种缺失胞浆段的突变体蛋白可竞争性抑制反向信号对活化后U937细胞因子mRNA的下调作用。结论:TM-TNF-α介导的反向信号可下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达;且TM-TNF-α胞浆段为其介导的反向信号所必需。

双导丝球囊血管成形术加支架术后血清TNF-α和IL-6测定及其临床意义

目的评价双导丝球囊血管成形术对血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)浓度的影响,并研究术后血清TNF-α和IL-6水平与远期心血管事件的关系。方法冠脉造影证实的冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者共80例,分为普通球囊组(41例)和双导丝球囊组(39例),所有患者采用酶联免疫吸附法测定术前、术中、术后即刻,术后6、24h血清TNF-α、IL-6水平,并随访术后6个月心血管事件,比较术后再狭窄患者与无再狭窄患者之间血清TNF-α、IL-6差异。结果再狭窄患者中普通球囊组术后6h TNF-α(107.39±27.97)ng/L、IL-6(65.71±8.38)ng/L均较术前(13.63±3.30)ng/L、(11.69±2.94)ng/L明显升高(tTNF-α=4.303,tIL-6=3.747,均P<0.05);双导丝球囊组术后6hTNF-α(36.89±10.16)ng/L、IL-6(48.13±9.16)ng/L均较术前(14.74±4.07)ng/L、(11.92±3.31)ng/L升高(均P<0.05);但普通球囊组升高更明显(P<0.05);而普通球囊组术后24h TNF-α(24.64±11.86)ng/L、IL-6(20.65±7.41)ng/L与术前比较差异无统计学意义(tTNF-α=1.386,tIL-6=1.134,均P>0.05);无再狭窄的普通球囊组患者和双导丝球囊组患者各时间段的TNF-α、IL-6水平均无显著变化(均P>0.05)。结论双导丝球囊组患者术后血管损伤较小、炎症反应较轻;冠脉血管成形术后6h TNF-α和IL-6升高可能是术后发生再狭窄的预报标志,对预测冠脉血管成形术后远期疗效具有一定的价值。

两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca^(2+)浓度变化的关系

目的 :比较分泌型TNF α(S TNF α)和跨膜型TNF α(TM TNF α)发挥细胞毒效应时 ,引起靶细胞内Ca2 + 浓度的变化。方法 :采用生物学活性检测法 ,观察两型TNF α对不同靶细胞的杀伤效应 ;用Fura 2检测细胞内Ca2 + 浓度的变化。结果 :TM TNF α可杀伤实验所用 6株靶细胞 ;而S TNF α则仅对其中两株有细胞毒效应。两型TNF α杀伤靶细胞时 ,均伴有明显的Ca2 + 浓度升高。用钙螯合剂EGTA(10mmol/L)预先处理靶细胞30min ,只能降低S TNF α作用的靶细胞内的Ca2 + 浓度 ,并使其细胞毒效应明显减弱 (P <0 .0 1) ;对TM TNF α无影响。结论 :两型TNF α发挥细胞毒效应时 ,均可引起靶细胞内钙离子的重分布 ,导致靶细胞内Ca2 + 浓度的升高 ,但S TNF α的作用还可能与促进胞外Ca2 +

一种快速简便的缺失突变方法

为了构建能表达稳定的、不易降解的ＴＭ－ＴＮＦ突变体（ＴＭ－ＴＮＦｍ）的基因，本文用改良的Ｓ－ＰＣＲ和ＯＥ－ＰＣＲ两种定位突变技术，成功地构建了缺失３６个碱基的ｐＢＳＫ－ＴＭ－ＴＮＦ突变重组体。与ＯＥ－ＰＣＲ技术（用两对引物进行两次ＰＣＲ反应）相比较，Ｓ－ＰＣＲ技术（用一对引物做一次ＰＣＲ反应）具有快速、经济、简便等优点，但其突变率较ＯＥ－ＰＣＲ低。

肌动蛋白样分子参与TNFRⅡ介导的TM-TNF-α杀瘤活性的研究

目的 寻找并研究参与TM TNF α杀瘤的协同分子 ,进一步揭示TM TNF α发挥生物学作用的特征 ,阐明其与S TNF α功能差异的分子机制。方法 利用免疫共沉淀法、质谱分析、Westernblot及细胞毒实验探索参与TM TNF α杀瘤功能的协同作用分子并确定其性质。结果 TM TNF α免疫共沉淀产物中发现一相对分子质量 (Mr)为 4 3× 10 3蛋白分子 ,用质谱分析及Westernblot证实该分子属于肌动蛋白家族 ;用抗肌动蛋白抗体封闭效应细胞和 或靶细胞后 ,TM TNF α对主要表达TNFRⅡ的肿瘤细胞HL 6 0的杀伤作用显著下降 ,而对主要表达TNFRⅠ的肿瘤细胞MCF 7则无影响。结论 Mr为 4 3× 10 3的肌动蛋白样分子可能参与并增强TM TNF α通过TNFRⅡ介导的杀瘤功能。

87位氨基酸在TM-TNF-α诱导靶细胞凋亡中的作用

目的 研究TM TNF α分子结构与功能的关系 ,阐明其诱导靶细胞凋亡的分子机制。方法 构建定点突变的 87/PheTM TNF pcDNA3.0 ,并瞬时转染Cos 7细胞 ,利用MTT法 ,annexinⅤ ,Westernblot检测TM TNF α突变体的胞毒效应 ,对靶细胞死亡方式及对核转录因子NF κB转位的影响。结果 87位氨基酸置换后 ,TM TNF α对靶细胞的杀伤率无明显改变 ,但TM TNF α突变体通过促进NF κB核转位 ,诱导靶细胞死亡的方式由凋亡转为坏死。结论 87位氨基酸是TM TNF α诱导靶细胞凋亡的关键氨基酸残基 。

TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937细胞的激活作用

目的 用sTNFRⅠ预先激活TM TNF α介导的反向信号 ,观测其对sTNF α激活单核细胞系U937细胞的影响。方法 预先用sTNFRⅠ与U937细胞作用 30min ,洗涤后加入sTNF α作用不同时间 ,观测预激活反向信号对sTNF α刺激U937产生活性氧、胞内促炎细胞因子TNF α、IL 1 β、IL 8mRNA的转录及IκB α水平 (Westernblot)的影响。结果 单独用sTNFRⅠ激活的反向信号并不影响U937细胞的功能 ,而预激活反向信号能协同增强sTNF α刺激U937细胞产生活性氧 ,且呈sTNFRⅠ浓度、sTNF α浓度依赖关系 ;预激活反向信号协同增强sTNF α刺激U937炎性细胞因子mRNA(TNF α、IL 1 β、IL 8等 )的转录水平 ;并促进U937细胞IκB α的降解。结论 预先激活TM TNF α介导的反向信号协同增强sTNF α对U937的激活作用 ,提示反向信号可能参与机体对早期炎症反应的调节。

多项指标联合检测诊断原发性肝癌的研究

目的 :探讨五项肿瘤标志物联检对提高原发性肝癌 (PHC)的检出率和早期诊断的意义。方法 :以甲胎蛋白 (AFP)的检测为主体配合谷氨酰转肽酶 (γ GT)、α L 岩藻糖苷酶 (AFU)、肿瘤坏死因子 (TNF α)和DR 70 TM五项指标对原发性肝癌 50例、肝外恶性肿瘤和肝硬化及健康人各 30例进行了血清检测。结果 :原发性肝癌患者多项指标含量与正常组比较均有明显差异或非常显著差异 (P <0 0 5和P <0 0 1)。各项指标除DR 70 TM和TNF α标志物对肝外恶性肿瘤和肝硬化比较差异无显著性外 ,其余指标各组间比较均有显著或非常显著差异 (P <0 0 5和P <0 0 1)。结论 :应用多项指标联合检测PHC的诊断率可达 98% ,尤其可提高小肝癌 (直径≤ 5cm)

噬菌体展示TM-TNF-α模拟肽体内杀瘤效应的研究

目的 研究噬菌体展示TM -TNF- α模拟肽的体内杀瘤效应及机制。方法 大量制备所需的噬菌体展示肽,比较不同展示肽对小鼠的肝癌细胞H2 2的体外杀瘤效应,挑取杀瘤效应最好的展示肽并选择其合适的滴度进行体内实验。小鼠接种H2 2细胞3d后,于肿瘤接种部位皮下注射噬菌体展示肽,观察肿瘤的生长情况。结果 噬菌体展示TM- TNF -α模拟肽在体内能明显抑制肿瘤的生长(P <0 .0 1)。且抑瘤率与展示肽之间呈剂量依赖关系。HE染色发现展示肽治疗组肿瘤组织中有大量淋巴细胞浸润,而sTNF- α治疗组除淋巴细胞浸润还可见中性粒细胞、浆细胞浸润。结论 直接注射噬菌体展示TM -TNF -α模拟肽可在体内有效杀瘤,其杀瘤机制可能不同于分泌型TNF -α。

急性脑梗死患者细胞因子水平变化的临床意义

目的测定急性脑梗死患者血清中IL-6、IL-8、TNF-α及TM的水平变化，探讨其临床意义。方法选取2008年7月至2010年7月65例急性脑梗死患者作为观察组，选取同期健康体检者50例作为对照组，采用ELISA检测病例组和对照组血清中IL-6、IL-8、TNF-α及TM的水平变化。结果脑梗死急性期及恢复期患者的IL-6、IL-8、TNF-α及TM水平均高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），恢复期脑梗死患者各细胞因子有所下降，与急性期相比差异有显著性（P〈0．05）。结论急性脑梗死患者IL-6、IL-8、TNF-α及TM水平的变化，对于急性脑梗死患者临床病情的判断及预测患者预后具有指导意义。