二甲双胍对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探讨二甲双胍对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞损伤的作用。方法将TM3小鼠睾丸间质细胞随机分为4组,分别为正常对照组、二甲双胍组、H_(2)O_(2)模型组以及H_(2)O_(2)+二甲双胍组。各组细胞培养24 h后,利用CCK-8法检测细胞存活率,ELISA检测TM3细胞睾酮的分泌情况,实时定量PCR检测睾酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD的mRNA表达情况,采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,Western blot检测TM3细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达情况。结果与正常对照组相比,H_(2)O_(2)模型组TM3细胞的睾酮水平显著降低,睾酮合成酶StAR、P450scc和17β-HSD的mRNA表达水平显著降低,细胞内SOD和CAT活性显著降低,细胞存活率亦显著降低(P均<0.05),MDA含量及Cleaved-caspase3表达水平显著升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)模型组相比,H_(2)O_(2)+二甲双胍组TM3细胞的睾酮水平显著升高,睾酮合成酶的mRNA表达水平显著升高,SOD和CAT活性显著升高,细胞存活率显著提高(P均<0.05),MDA含量及Cleaved-caspase3表达水平显著降低(P<0.05)。结论二甲双胍可减轻H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞功能损伤。

白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用,并探索其可能的作用机制。首先,用不同浓度(0、150、200、250、300μmol/L)的过氧化氢(H2O2)处理小鼠睾丸间质细胞TM3 8 h,确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度;然后,用不同浓度(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)的RES分别处理正常细胞24 h,确定RES安全浓度;最后,用安全浓度的RES处理氧化损伤细胞24 h。在整个培养过程中采用i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测细胞的增殖情况;待安全浓度的RES处理氧化损伤细胞结束后采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)法分别检测沉默调节蛋白1(SIRT1)/解偶联蛋白2(UCP2)信号通路中关键因子SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明:1)用浓度为150μmol/L及以上的H2O2处理细胞8 h后,极显著降低细胞存活率(P<0.01),因此确定150μmol/L为建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。2)用10.0μmol/L及以下浓度的RES处理正常细胞24 h后,细胞存活率均无显著变化(P>0.05);用2.5、5.0和10.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞存活率均显著提高(P<0.05),且各浓度RES组间无显著差异(P>0.05)。因此,选用5.0μmol/L为RES的安全浓度。3)用5.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞中ROS的含量极显著降低(P<0.01);细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的相对表达量极显著增加(P<0.01),而UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量则显著或极显著降低(P<0.01或P<0.05)。由此可见,适宜浓度的RES可激活SIRT1同时抑制UCP2的表达,UCP2通过负反馈调节方式减少细胞内ROS的生成,从而在一定程度上抑制TM 3细胞的氧化损伤。

普罗布考对H_(2)O_(2)诱导的TM3小鼠睾丸间质细胞内氧化应激和细胞凋亡的影响

目的探究普罗布考对过氧化氢(H_(2)O_(2))介导的小鼠睾丸间质细胞系(TM3)损伤的影响。方法体外培养TM3细胞,分为3组:对照组、H_(2)O_(2)损伤模型组和普罗布考处理组。CCK8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,活性氧(ROS)检测试剂盒检测细胞内ROS水平,ELISA测定细胞上清睾酮水平,实时荧光定量PCR检测细胞内睾酮合成酶类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)和17β-羟基类固醇脱氢酶(HSD-17β)、细胞凋亡指标Bax、Caspase3和氧化应激相关指标核因子E2相关因子2(NRF2)、血红素加氧酶-1(HO-1)的mRNA水平,Western blot检测细胞内Bax和Caspase3蛋白表达改变。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)损伤模型组细胞存活率显著降低、凋亡率显著升高(P<0.05),Bax和Caspase3表达显著上调(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高、NRF2和HO-1水平显著降低(P<0.05),睾酮分泌量和睾酮合成酶表达显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)损伤模型组比较,普罗布考处理组细胞存活率显著升高、凋亡率显著下降(P<0.05),Bax和Caspase3表达显著下调(P<0.05),细胞内ROS水平显著下降、NRF2和HO-1水平显著升高(P<0.05),睾酮分泌量和睾酮合成酶表达增高(P<0.05)。结论普罗布考可以减轻H_(2)O_(2)诱导的TM3细胞凋亡和睾酮合成异常,这种保护作用可能与普罗布考的抗氧化和抗凋亡效应有关。

双酚A通过上调Apoa 1基因的表达抑制TM3细胞睾酮合成

旨在从脂质代谢的角度探讨载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,Apoa 1)是否介导了双酚A(bisphenol A,BPA)暴露所致小鼠睾丸间质细胞株(TM3)睾酮合成的降低。将TM3细胞随机分为不同浓度的BPA暴露剂量(0、5、10、20、40、60、80μmol·L^(-1))组,0μmol·L^(-1)BPA为对照组(CON)。给予相应剂量处理24 h后,运用CCK-8法检测TM3细胞活力,确定BPA最适染毒剂量;通过ELISA检测TM3细胞培养上清液睾酮(testosterone,T)含量;利用RT-qPCR检测TM3细胞脂质代谢相关基因Apoa1、Apoa 2(apolipoprotein A2)、Apoc 3(apolipoprotein C3)的mRNA表达水平;运用Western blot和免疫荧光方法检测APOA1蛋白表达水平;采用油红O染色观察细胞内脂滴累积情况。结果表明,20μmol·L^(-1)BPA处理24 h对TM3细胞活力无显著影响,40μmol·L^(-1)BPA处理24 h后,TM3细胞活力受到极显著抑制(P<0.01);此外,20μmol·L^(-1)BPA处理TM3细胞24 h后,培养上清液中睾酮含量极显著低于对照组(P<0.01),Apoa 1基因的mRNA表达水平及蛋白表达量极显著升高(P<0.001),但Apoa 2和Apoc 3基因的mRNA表达水平无显著变化;与对照组相比,20μmol·L^(-1)BPA处理24 h,TM3细胞的脂滴累积量极显著降低(P<0.0001)。综上,BPA可通过上调Apoa 1基因的表达水平,增强胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT),引起TM3细胞内的脂滴含量减少,导致TM3细胞的睾酮合成分泌降低。

鹿尾蛋白与多肽制备工艺优化及其对TM3细胞增殖活性研究

以梅花鹿尾为研究对象,采用正交试验优化超声水提蛋白工艺及水酶法提取多肽工艺,比较两种最佳工艺所得物对小鼠睾丸间质细胞(TM3)增殖活性的影响。结果表明,超声水提蛋白工艺最佳条件为料液比1∶5 g/mL、超声功率200 W、提取时间1 h、提取温度40℃,在此条件下蛋白含量为60.72%±0.56%;水酶法提取多肽工艺中最佳蛋白酶为胰蛋白酶,酶解最佳条件为pH8、加酶量1500 U/g、酶解时间4 h、提取温度50℃,在此条件下水解度为22.85%±0.35%。水酶法提取鹿尾多肽对小鼠睾丸间质细胞(TM3)增殖活性优于超声水提鹿尾蛋白。

钼对TM3小鼠睾丸间质细胞周期和凋亡的影响

以体外培养的小鼠睾丸间质细胞系TM3 为材料,加入不同质量浓度的钼酸钠溶液(0,10,20,40,80,160mg/L)染毒培养,分别在干预4,8,12,24,48h采用MTT法检测细胞的增殖。干预48h后,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的变化。结果表明:与对照组相比,不同剂量钼酸钠作用24h后,睾丸间质细胞的增殖活性均受到抑制;不同质量浓度的钼酸钠作用48h后,细胞周期阻滞于G0/G1期,20mg/L及其以上剂量组G0/G1期细胞百分率与对照组相比显著升高(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,各剂量组TM3 小鼠睾丸间质细胞凋亡率显著升高,差异极显著(P<0.01);细胞尾部DNA含量及细胞尾长随着钼剂量的增加呈不同程度的增加,且存在着剂量—效应关系。结论说明钼能够引起睾丸间质细胞周期的紊乱,并诱导睾丸间质细胞发生DNA损伤和凋亡。

不同温补肾阳中药有效成分对TM3小鼠睾丸间质细胞生长抑制作用比较研究

目的比较不同温补肾阳中药有效成分对睾丸间质细胞生长的影响。方法以小鼠TM3睾丸间质细胞为实验对象,分别采用10、20、40、80、160和320μmol·L^(-1)淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、松脂醇二葡萄糖苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷和耐斯糖处理细胞24h、48h和72h,并设置0.1%DMSO为对照组,运用MTT方法检测各时点细胞增殖情况。结果铺板24~72h内,对照组细胞进入快速的指数生长期;同一时点,与对照组比较,40~320μmol·L^(-1)淫羊藿苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),80~320μmol·L^(-1)补骨脂素和异补骨脂素显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),320μmol·L^(-1)松脂醇二葡萄糖苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05),大于160μmol·L^(-1)仙茅苷显著抑制TM3细胞增殖(P<0.05)。然而,各浓度的金丝桃苷、松果菊苷和耐斯糖对TM3细胞生长无明显抑制作用。结论相同浓度的各温补肾阳中药有效成分对小鼠TM3睾丸间质细胞增殖抑制作用由强到弱分别是,淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、松脂醇二葡萄糖苷、仙茅苷、金丝桃苷、松果菊苷、耐斯糖。

佛司可林对小鼠睾丸间质细胞雄激素合成酶及调节分子的影响

目的:研究佛司可林(FSK)对小鼠睾丸间质细胞雄激素合成的影响。方法:以TM3小鼠睾丸间质细胞为实验对象,分别采用1μmol/L、10μmol/L FSK处理TM3细胞15 min^24 h等不同时间,运用ELISA方法检测细胞分泌液睾酮含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测细胞的雄激素合成相关基因mRNA表达。结果:与对照组比较,1μmol/L FSK处理24 h后对睾酮分泌无明显影响(P>0.05),但FSK可显著增强TM3细胞类固醇急性调节蛋白(Star)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)基因表达上调(P<0.01);对17α羟化酶(Cyp17a1)、3β羟基类固醇脱氢酶(Hsd3b2)和黄体生成素受体(Lhr)基因表达无明显作用(P>0.05)。与对照组比较,采用10μmol/L FSK干预TM3细胞15 min^12 h,干预1 h起即可显著增强Star基因表达上调20倍以上(P<0.01);干预4 h起显著促进Cyp11a1基因表达上调4倍以上(P<0.05,P<0.01);FSK作用15 min起即可上调核受体Nr4a1基因表达(P<0.05),作用1 h时可显著增强Nr4a1基因表达上调达80倍(P<0.01);FSK干预1 h后可显著促进核受体Nr4a2基因表达上调达100倍以上(P<0.01);FSK作用8 h后才明显上调核受体Nr5a1基因表达(P<0.05)。结论:FSK能促进TM3小鼠睾丸间质细胞雄激素合成起始环节限速酶与即刻早期转录因子核受体基因转录,有助于雄激素合成前体物质孕烯醇酮以增加储备。

过氧化氢诱导TM3细胞氧化应激模型建立

目的构建过氧化氢(H2O2)诱导小鼠睾丸间质细胞(TM3)氧化应激模型,为肥胖相关雄性生殖功能低下机制研究提供参考。方法分别以不同浓度H2O2处理TM3细胞4 h,采用噻唑蓝法测定细胞活力,酶联免疫吸附试验检测睾酮水平,比色法测定细胞内活性氧(ROS)含量、总抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性。结果 300、600μmol/L H2O2组细胞存活率[(86.7±4.3)%、(46.3±2.0)%]均低于对照组[(100.0±1.7)%](P<0.05);与对照组[(250.09±26.70)pg/m L]比较,150、300、600μmol/L H2O2组TM3细胞睾酮水平[(188.93±7.06)、(179.23±6.66)、(131.59±11.26)pg/m L]均明显降低(P<0.05);与对照组比较,150、300、600μmol/L H2O2组TM3细胞SOD和CAT活性[分别为(2.42±0.17)、(2.69±0.30)、(0.44±0.41)和(56.76±12.17)、(23.45±2.17)、(24.55±18.05)U/mg protein]均明显下降(P<0.05)。结论成功构建以H2O2为诱导剂的TM3细胞体外氧化应激模型。

TFEB介导的溶酶体功能障碍在ZEA致TM3细胞凋亡中的作用

为揭示玉米赤霉烯酮(ZEA)的雄性生殖毒性机理,对转录因子EB(TFEB)介导的溶酶体功能障碍在ZEA致TM3细胞凋亡中的作用进行了研究,试验以小鼠睾丸间质细胞株(TM3细胞)为材料,用0(对照组)、5、10μmol/L ZEA分别处理细胞24 h,流式细胞术检测TM3细胞内Lysotracker水平;Western-blot检测凋亡相关蛋白CC3、CC9、Bax、Bcl2,溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2,组织蛋白酶B(CTSB)、D(CTSD)以及细胞质内TFEB蛋白等的表达水平。过表达TFEB,Western-blot检测CC3、CC9、Bax、Bcl2表达水平。结果显示,与对照组相比,ZEA处理组Bax、CC3、CC9表达水平显著上升而Bcl2表达水平显著下降(P<0.05);流式细胞术检测结果显示溶酶体膜稳定性下降;CTSD和CTSB表达水平显著升高(P<0.05),LAMP2和TFEB表达水平显著降低(P<0.05),LAMP1表达水平在ZEA为5μmol/L时显著降低(P<0.05)。与ZEA组相比,TFEB过表达后ZEA组的Bax、CC3和CC9蛋白表达水平显著下降(P<0.05),而Bcl2表达水平显著上升(P<0.05),过表达TFEB可缓解ZEA引起的凋亡。结果表明,ZEA可引起TM3细胞凋亡增加,其作用机制与破坏TFEB信号通路,导致溶酶体出现功能障碍有关。