D-半乳糖刺激小鼠睾丸TM4支持细胞分泌功能的衰退及其机制

目的采用D-半乳糖(D-Gal)刺激小鼠TM4睾丸支持细胞,建立衰老所致TM4细胞分泌功能衰退模型。方法将小鼠TM4睾丸支持细胞分为正常对照组、(25、50、100、150、200、250)mmol/L D-Gal刺激组。MTT法检测TM4细胞活力、流式细胞术检测细胞周期、光镜观察细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老细胞百分率;反转录PCR检测P21、P16、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和干细胞因子(SCF)的mRNA水平;Western blot法检测GDNF、SCF、红系2样核因子2(nuclear factor,erythroid 2 like 2,NRF2)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)的蛋白水平。结果与正常对照组比较,D-Gal刺激组细胞活力显著下降;处于G1期的细胞比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1期;SA-β-Gal染色阳性率明显增多,衰老基因P21 mRNA表达上调,GDNF和SCF mRNA及蛋白水平均显著下调;氧化应激相关蛋白NRF2、HO-1和NQO-1的蛋白水平显著降低。结论成功建立D-Gal刺激的TM4睾丸支持细胞分泌功能衰退模型,衰老机制可能与下调NRF2信号通路有关。

枸杞多糖对顺铂诱导小鼠睾丸支持细胞TM4氧化损伤的影响

目的:研究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)对顺铂(cis-dichlorodiamineplatinum(Ⅱ),CDDP)诱导的小鼠睾丸支持细胞TM4氧化损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:噻唑蓝法测定CDDP、LBP分别对TM4细胞生长的影响以及LBP对CDDP诱导的细胞毒性的拮抗作用。硫代巴比妥酸法测定细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力。结果:5~100 mg/L LBP可极显著提高TM4细胞存活率(P<0.01),20~100 mg/L LBP能够极显著抑制CDDP造成的细胞毒性(P<0.01),50 mg/L的LBP保护效果最佳。50 mg/L LBP能够极显著抑制CDDP(12 mg/L)引起的MDA含量升高以及GSH含量和SOD活力降低(P<0.01)。结论:LBP能有效拮抗顺铂诱导的TM4细胞氧化损伤,其机制与LBP较强的抗氧化作用有关。

基于内质网应激探讨淫羊藿苷对TM4细胞损伤的保护作用

目的:基于内质网应激(ERS)探讨淫羊藿苷对D-半乳糖(D-Gal)诱导的小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞损伤的保护作用。方法:将TM4细胞分为正常对照组、模型组及淫羊藿苷低(0.5μmol/L)、高(1.0μmol/L)浓度组。Western blot法检测TM4细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1及内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1、ATF6表达水平。结果:Western blot结果显示,与正常对照组比较,模型组细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1及内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1、ATF6表达显著降低(P<0.01),给予淫羊藿苷干预后上述蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:淫羊藿苷可减轻D-Gal诱导的TM4细胞损伤,其机制可能与上调内质网应激信号通路有关。

Cox7a2荧光载体构建及其对小鼠支持细胞细胞色素C氧化酶活性的影响

目的构建pEYFP-Cl-Cox7a2表达载体，研究其在小鼠睾丸支持细胞（TM4）中的表达及对细胞色素C氧化酶（COX）活性的影响。方法应用RT—PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2，利用BamHI和EcoRI酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP—C1载体，经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定，并将重组质粒pEYFP—C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48h，采用分光光度计测定COX活性。结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列，大小为252bp。构建pEYFP—CI．Cox7a2表达载体，经酶切、测序鉴定证实克隆正确，转染TM4细胞的效率达70％，融合蛋白表达产物相对分子质量为37000。重组质粒转染后6、12、24、48h时COX活性分别为（0．642±0．051）、（0．542±0．049）、（0．311±0．021）和（0．216±0．010）U／mg，不转染组和转染空载体组分别为（0．714±0．064）、（0．653±0．031）U／mg。与不转染组相比，重组质粒转染后12、24、48h组COX活性显著降低（P〈0．05）。结论重组质粒pEYFP—Cl-Cox7a2载体成功构建。CoxTa2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用，可能对调控COX活性发挥重要作用。

五子衍宗丸含药血清对小鼠睾丸支持细胞分泌功能及自噬的影响

目的:探讨五子衍宗丸含药血清对小鼠睾丸TM4支持细胞分泌功能及自噬的影响。方法:构建慢病毒空载体和细胞色素C氧化酶7a2(Cox7a2)慢病毒载体,并转染TM4细胞;制备正常小鼠空白血清,溶剂对照血清,五子衍宗丸低、高浓度含药血清,分别与转染Cox7a2慢病毒细胞共培养24h后,采用流式细胞仪检测细胞中ROS水平,Western blot法检测细胞中自噬基因LC3和Beclin 1的表达,ELISA法检测细胞中TF和INHB的含量。结果:与TM4正常细胞组比较,转染Cox7a2慢病毒细胞组中ROS水平明显升高(P<0.01),LC3、Beclin 1的表达均降低(P<0.01,P=0.32),TF、INHB的含量均下降(P<0.01,P=0.19);给予五子衍宗丸低、高浓度含药血清共培养后,转染Cox7a2慢病毒细胞中升高的ROS水平均降低(P<0.01,P=0.52),降低的LC3、Beclin 1表达均增高(P<0.05,P<0.01),TF、INHB的含量均明显升高(P<0.01)。结论:Cox7a2过表达可产生过量的ROS,TM4支持细胞自噬水平下降,导致细胞分泌功能障碍;五子衍宗丸含药血清可通过调节ROS和自噬水平,进而改善TM4支持细胞分泌功能。