PGC介导的TMEM182基因敲除性腺嵌合体鸡的制备

为深入研究TMEM182基因在鸡体内的功能和表现,试验采用原始生殖细胞介导法,利用CRISPR/Cas9介导的HMEJ基因编辑技术,对体外培养的原始生殖细胞TMEM182基因进行敲除,以期产生TMEM182基因缺陷性腺嵌合体鸡。选择3个sgRNA靶向TMEM182基因的第二外显子,利用T7E1进行基因打靶效率检测。对体外培养的PGCs进行外源基因mCherry定点插入,引起TMEM182基因插入突变,通过流式分选获得mCherry+PGCs。将mCherry+PGCs注射到发育至2.5 d的受体鸡胚,观察外源PGCs的性腺整合情况。结果显示:TMEM182-sgRNA1的打靶效率最高;通过将sgRNA1与模板质粒共转染PGCs,得到能稳定表达红色荧光的mCherry+PGCs;孵化第6天,在受体鸡胚性腺能明显观察到发出红色荧光的PGCs,最终孵化出10只小鸡。研究表明:利用CRISPR/Cas9技术对鸡PGCs进行基因编辑,制备性腺嵌合体鸡是一种高效、稳定的制备基因编辑鸡的方法。

绵羊TMEM182基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

【目的】本试验旨在克隆绵羊TMEM182基因编码区(CDS)全长序列,并通过在线软件分析TMEM182基因结构和表达蛋白序列,以探究其在绵羊各部位组织中表达水平的变化。【方法】从绵羊尾部脂肪组织中克隆获得TMEM182基因,利用在线生物学信息软件对TMEM182蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、糖基化位点、信号肽、二级结构、三级结构和蛋白互作等进行预测分析。同时,采用实时荧光定量PCR方法检测TMEM182基因在绵羊13个组织中的相对表达量,这些组织包括大脑、小脑、心、肾、脾、肝、肺、皮肤、卵巢、尾部脂肪、皮下脂肪、肾周脂肪和肌肉。【结果】绵羊TMEM182基因CDS区全长序列为690bp,编码229个氨基酸,TMEM182基因序列在不同物种间具有较高的保守性。生物信息学预测分析显示,TMEM182属于稳定的疏水性蛋白,具有跨膜结构,无信号肽,具有3个N-糖基化位点,其蛋白二级结构主要由无规则卷曲(38.43%)和2α螺旋(30.57%)组成,而延伸链(24.89%)和β转角(6.11%)的占比相对较少,三级结构预测结果与二级结构预测结果相符。实时荧光定量PCR结果显示,TMEM182基因在肌肉、心和脂肪中表达量显著高于肝、肾、大脑、小脑、皮肤等其它部位组织(P<0.05)。【结论】成功克隆了绵羊TMEM182基因的CDS区片段,分析了该基因在绵羊肌肉组织和脂肪组织中特异性表达。这些研究结果为进一步探究TMEM182基因在绵羊肌肉生长发育和脂肪沉积过程中的分子作用机制提供了理论依据。