基于SPR系统的TMP-Fc免疫原性分析方法建立与应用

目的:利用Biacore 3000 Gx P系统建立并验证基于表面等离子体共振(SPR)技术的免疫原性分析方法,对2种重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(TMP-Fc)在食蟹猴体内的免疫原性(IM)进行比较研究。方法:采用食蟹猴连续皮下注射候选药LMF(L,100,300,1 000μg·kg^(-1))或参照药romiplostim(R,300μg·kg^(-1))后采集血清样品,用验证的IM分析方法检测样品中的抗药抗体(ADA)。筛选阈值(CP)采用信噪比(S/N)进行计算;确证阈值(SCP)经免疫抑制试验确定;其他验证指标包括灵敏度、分析范围与Hook效应、药物耐受性与精密度。结果:候选药与参照药筛选阈值分别为CPL1.54和CPR1.41。确证阈值分别为SCPL37.6%和SCPR40.9%;配制于混合食蟹猴血清(PCMS)中的阳性质控(PC)浓度为1~64μg·mL^(-1),参数模型拟合良好,未见Hook效应。二者方法灵敏度分别为556和463 ng·mL^(-1)。药物耐受性数据表明样品S/N值随药物浓度升高而降低,其信号抑制比率(inhibition)反之升高。所有阴性质控(NC)、低浓度LPC与抗体血清rs PC样品变异系数(CV)均不高于25%。样品分析结果表明各给药组均有个体检出ADA,相同剂量下L和R的ADA阳性率均为50%;2种方法(anti-L,anti-R)对R的样品检测阳性个体及其检测时间点高度吻合。结论:本研究建立并验证了基于SPR系统的IM分析方法。方法符合生物制品IM研究要求,并成功应用于2种TMP-Fc生物样品的ADA检测。

重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白抗体中和活性检测方法的建立

目的:建立重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(TMP-Fc)抗体中和活性的检测方法,并应用于免疫原性研究中的样品分析。方法:基于MO7e细胞依赖于TMP-Fc增殖的活性检测方法,以及TMP-Fc的阳性中和抗体对MO7e细胞增殖的抑制作用,建立TMP-Fc抗体中和活性检测方法。结果:TMP-Fc对MO7e细胞的增殖具有促进作用,在3.2~80 ng/m L浓度范围内作用显著;阳性血清稀释率低于1/10 000时,对MO7e细胞的增殖有明显抑制作用;检测方法经优化,确定最佳血清稀释率为1/20,最佳药物浓度为16 ng/m L;实验阈值(CP)确定为23.78%。免疫原性结果显示,TMP-Fc与罗米司亭在300μg/kg剂量下中和抗体个体发生率分别为30%和40%,表明二者在免疫原性方面类似。结论:建立了一种TMP-Fc抗体中和活性检测方法,并应用于免疫原性研究的样品分析,为TMP-Fc在长期毒性实验中的免疫原性评价提供了有效的检测手段。

应用ELISA检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白中卡那霉素残留量

目的:建立灵敏度更高的ELISA方法检测卡那霉素残留量并进行方法学验证,用于重组生物制品的质量控制。方法:采用直接竞争ELISA方法,样品中残留的卡那霉素将和酶标抗原竞争酶标板上预包被的卡那霉素抗体,用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物显色,样品吸光值与残留卡那霉素的含量成负相关,用酶标仪进行检测并用Ridasoft Win分析软件进行分析。结果:此方法灵敏度高,在0.2～3.0 ng·mL^(-1)范围内spline拟合良好,且平行复孔RSD小于10%;方法精密度良好,加标回收率在80%～120%之间。应用该方法对1批注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(简称TMP-Fc)成品的卡那霉素残留量进行测定,结果表明,每瓶TMP-Fc(250μg)卡那霉素残留量小于0.2 ng。结论:该方法具有灵敏度高、操作便捷、检测迅速等特点,可以用于重组生物制品中卡那霉素残留量的质量控制。

MO7e细胞增殖法检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白生物活性方法的建立和验证

目的:建立并验证用于检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(recombinant human thrombopoietin mimetic peptide-Fc fusion protein,TMP-Fc)生物活性的MO7e细胞增殖法,用于TMP-Fc的质量控制。方法:以人巨核细胞白血病细胞株MO7e作为基质细胞,不同浓度的TMP-Fc与MO7e细胞作用,与其表面血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受体结合,刺激细胞增殖,通过比色法测定细胞增殖情况来评价TMP-Fc的生物学活性,其结果用质控参考品进行校正。从显色方法、作用时间、TMP-Fc稀释率等多个方面对实验条件进行优化。对方法的专属性、线性与范围、准确度及精密度进行验证。结果:MO7e细胞对TMP-Fc有很好的剂量反应关系,方法专属性良好;线性范围为0.006 4～2 500 ng·m L-1,相关系数≥0.99;回收率在80%～120%之间。3批原研品和3批TMP-Fc经3次重复测定,其RSD均在15%之内,说明方法精密度良好;其活性分别为(193 152±6 799)～(219 187±11 390)U·mg-1和(207 822±30 423)～(228 549±15 865)U·mg-1,采用One-way ANOVA统计分析,组间P值大于0.05,说明TMP-Fc生物学活性与原研品相似。结论:建立并验证测定TMP-Fc生物活性的MO7e细胞增殖法,该方法具有较好的专属性、准确度和精密度,可用于TMP-Fc的生物学活性评价和质量控制。