基于TMT标记定量蛋白质组学技术研究中药复方益糖康改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制

目的研究db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的发病机制及中药复方益糖康对其的改善作用。方法9周龄健康雄性SPF级db/db小鼠16只、db/m小鼠8只,分别设置模型组、益糖康组、空白组,益糖康组使用30 g·kg^(-1)·d^(-1)的中医复方益糖康煎剂进行灌胃,其余两组予以等体积的生理盐水灌胃,5周后进行取材,分离各组小鼠的骨骼肌组织。所有样本经TMT 10标试剂进行标记定量、蛋白酶解、TMT肽段标记与肽段分级、LC-MS/MS分析后,用数据库检索方法确定差异蛋白,并进行生信分析。结果所选取的样本稳定,有较高的科学价值;与db/m正常小鼠相比,db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗总共导致Amd1、Serpina1e、Sorbs3、Fabp4、Myl3、Upf2等109个蛋白的表达变化,涉及了糖酵解、脂肪酸氧化、ATP的合成及供能等生物过程及PPAR、支链氨基酸代谢等信号通路;中药复方益糖康可以改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗,总共涉及了Pcolce、Pgk2、Trip11、Tmem41b、Mrps9、Bola2等49个蛋白的表达变化,通过调节三羧酸循环,乙醛酸和二羧酸代谢等通路实现;中药复方益糖康可以产生心血管受益,并能缓解由2型糖尿病及胰岛素抵抗导致的帕金森病、亨廷顿病。结论db/db小鼠是研究2型糖尿病及胰岛素抵抗的理想模型,TMT标记定量蛋白质组学技术可以精准发现相关差异蛋白,结果较权威;脾虚导致的骨骼肌线粒体功能障碍是2型糖尿病及胰岛素抵抗发病的原因之一;中药复方益糖康可以对2型糖尿病及胰岛素抵抗异常的生物过程起到纠正作用,与健脾修复线粒体损伤、促进线粒体自噬有关;整个实验过程筛选的差异蛋白及所涉及的生理病理变化是课题组下一步研究的重点。

食管癌患者血浆外泌体蛋白标志物TMT定量蛋白质组学筛选及分析

目的探讨食管癌患者血浆外泌体蛋白的表达变化,筛选并分析食管癌诊断的生物标志物。方法采用定量蛋白质组学串联质量标签(TMT)标记技术对3例食管鳞状细胞癌患者及3例健康体检者的血浆外泌体蛋白进行检测及定量分析,筛选食管癌患者血清外泌体中发生显著性变化的差异蛋白。采用Proteome Discoverer、STRING等数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。结果共鉴定出17种显著差异表达蛋白,其中显著上调蛋白6个,显著下调蛋白11个。GO功能注释、COG注释、KEGG通路注释和结构域注释显示差异蛋白主要包括蛋白酶抑制剂的羧肽酶、细胞外基质1、分泌磷蛋白24、ERV/ALR硫代氧化酶、血小板反应蛋白/软骨寡聚基质蛋白的卷曲螺旋结构域、胎球蛋白B半胱氨酸蛋白酶抑制结构域。结论定量蛋白质组学TMT法能有效筛选食管癌患者血浆外泌体中的差异蛋白,筛选出的差异蛋白有望成为食管癌诊断的标志物。

基于串联质谱标签的蛋白质组学联合高内涵筛选技术筛选胃癌相关基因的研究

目的:应用Tandem mass tag(TMT)技术联合高内涵筛选(HCS)寻找潜在的胃癌相关基因。方法:利用TMT技术从胃癌及癌旁组织中筛选差异表达蛋白质,应用GO和KEGG数据库进行注释和信号通路富集并结合PubMed数据库结果,筛选出胃癌中未见或较少报道的上调目的基因。通过shRNA技术敲减基因,HCS技术比较敲减对细胞增殖的影响,筛选出肿瘤增殖相关基因并通过检测mRNA含量、克隆形成和CCK8进行验证。结果:通过TMT从胃癌和癌旁组织定量到差异表达蛋白1008个(上调649个,下调359个),25个目的基因敲减后HCS结果显示SF3B4敲减抑制细胞增殖,验证发现SF3B4是潜在的胃癌细胞增殖相关基因。结论:TMT技术结合HCS为肿瘤相关基因的筛选提供新的可能性。本研究提示SF3B4是潜在的胃癌增殖相关基因,为研究胃癌发生机制提供新线索。

白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究

目的本文通过开展白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究,发现和鉴定白癜风患者病变表皮与正常表皮之间的差异表达蛋白,以探讨白癜风患者表皮发生病变的分子机制。方法首先,建立和优化了表皮样品中蛋白质的最佳酶切条件。其次,采用基于串联质谱标签(TMT)标记的定量蛋白质组学技术策略开展了稳定期白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究,并筛选了差异表达蛋白。最后通过生物信息学分析工具及数据库(GO、KEGG、STRING、GSEA)对差异蛋白进行功能富集分析。结果优化所得到的最佳酶解条件是由Lys-C(酶∶底物,1∶100)和胰酶(酶∶底物,1∶50)组合而成的顺序酶切。比较蛋白质组学研究共鉴定4496个蛋白质,其中181个蛋白质为白癜风患者病变表皮中的差异表达蛋白。生物信息学分析表明差异表达蛋白主要与代谢、免疫、氧化还原和细胞黏附相关。其中119个上调蛋白主要参与角质化、转录、氧化应激及蛋白酶解等过程。62个下调蛋白主要参与细胞内物质运输、谷胱甘肽代谢和肌动蛋白细丝封端等过程。结论比较蛋白质组学研究揭示了白癜风患者病变表皮与正常表皮之间主要存在角质化、免疫、脂质代谢和氧化还原等方面的功能差异,发现了PRDX1、PRDX2、EEF2、ITGB1、SPTBN2、ANXA1及PFKL等蛋白质为潜在的白癜风患者病变表皮功能失调的关键蛋白质。

基于肝脏TMT标记定量蛋白质组学技术研究越鞠丸防治“双心疾病”的作用机制

目的:观察越鞠丸治疗“双心疾病”的效果,并研究其中的作用机制。方法:选用6周龄健康雄性SPF级载脂蛋白E敲除(AopE^(-/-))小鼠30只、同源C57BL/6J小鼠10只进行实验。将30只AopE^(-/-)小鼠分为模型组、越鞠丸低剂量组(7.58 g·kg^(-1)·d^(-1))、越鞠丸高剂量组(30.32 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只;C57BL/6J小鼠10只作为空白组,各组灌胃12周。饲养期间通过慢性不可预知应激刺激(CUMS)联合高脂饲料诱导的方法构建“双心疾病”模型。灌胃给药后,通过各组小鼠行为学实验结果[旷场实验(OFT)、糖水偏嗜实验(SPT)]、全自动生化分析仪检测小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量及小鼠主动脉、肝脏油红O、苏木素-伊红(HE)染色,心肌组织Masson染色进行模型评价。最后通过肝脏TMT标记定量蛋白质组学技术研究其中的作用机制。结果:模型小鼠出现明显的抑郁、焦虑、兴趣丧失、绝望等表现,主动脉、肝脏病理观察也出现明显脂质沉积,心肌组织出现明显心肌纤维化增多的表现,越鞠丸灌胃给药后能改善“双心疾病”模型小鼠的上述症状与指标。与空白组比较,第12周模型组小鼠站立次数、中心区域累计时间、总移动距离、移动速度、糖水偏嗜率均显著下降(P<0.01),与模型组比较,越鞠丸低、高剂量组小鼠上述指标均显著降低(P<0.01)。取材后,与空白组比较,模型组AST、ALT、TG水平显著增多(P<0.01),5-HT、NE、HDL-C水平均显著下降(P<0.01)。肝脏TMT标记定量蛋白质组学结果提示“双心疾病”模型小鼠主要引起ApoE、UDP葡醛酸基转移酶家族1成员A5(UGT1A5)、FASN等蛋白表达水平的变化,涉及乙酰辅酶A代谢、对细菌的反应、细胞氨基酸分解代谢等过程,与肝脏代谢功能异常有关。越鞠丸防治“双心疾病”涉及了高迁移率族核小体结合域2(HMGN2)、CALD1、Mup7等蛋白表达水平的变化,并对“双心疾病”发病有关的生物过程和异常的通路起到纠正作用,主要有肌肉收缩、紧密连接通路、心肌收缩通路、黏着斑通路等。结论:CUMS联合高脂饲料诱导AopE^(-/-)小鼠构建“双心疾病”模型方法合理;越鞠丸可以纠正“双心疾病”模型小鼠抑郁、焦虑状态,同时能减轻其主动脉斑块并纠正异常的血脂、肝功水平;可纠正“双心疾病”模型小鼠的异常生物过程与通路;实验筛选的差异蛋白及所涉及的生理病理变化是下一步研究的重点。

基于TMT标记蛋白质组学技术研究接装纸赋甜对唾液蛋白表达的影响

为从蛋白质水平解析卷烟接装纸赋甜技术对人体产生的影响,采用串联质谱标签(TMT)标记的定量蛋白质组学技术对收集的不抽吸对照组、抽吸赋甜卷烟组以及抽吸未赋甜卷烟组唾液中的蛋白进行鉴定和分析。结果表明:(1)从3组样本中共鉴定到2099个蛋白,其中,从对照组、赋甜卷烟组及未赋甜卷烟组均鉴定到2042个蛋白;(2)与对照组相比,抽吸未赋甜卷烟组共有107个差异表达蛋白,从抽吸赋甜卷烟组仅鉴定到5个差异表达蛋白。与赋甜卷烟组相比,从未赋甜卷烟组唾液中共鉴定到59个差异蛋白,其中,上调蛋白有55个,下调蛋白有4个;(3)GO富集分析和KEGG通路分析表明,与赋甜卷烟组相比,未赋甜卷烟组差异表达蛋白在细胞对化学刺激响应相关的生物过程以及与有机酸结合的分子功能等方面显著富集,主要涉及代谢途径和药物代谢其他酶通路等。上述结果表明抽吸未赋甜卷烟对口腔产生较大的刺激,而抽吸赋甜卷烟对口腔影响明显减少。

T10脊髓损伤后T10~L2脊髓组织中差异表达蛋白的生物信息学分析

目的利用TMT标记定量蛋白质组学技术筛选出T10脊髓损伤后T10~L2脊髓组织的差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)并对其进行生物信息学分析,以期挖掘出T10脊髓损伤后膀胱颈功能障碍(bladder neck dysfunction,BND)的潜在治疗靶点。方法40只大鼠采用随机数字表法分为假手术组(12只)和造模组(28)只,造模组28只大鼠采用Hassan Shaker脊髓横断法制备T10脊髓损伤模型,从符合要求的模型大鼠中随机抽取12只作为模型组。所有大鼠行尿流动力学检测和HE染色,采用TMT检测出T10~L2脊髓组织中表达的蛋白质,将差异倍数(fold change,FC)>1.2或<1/1.2、P<0.05、unique peptide≥2的蛋白质定义为DEPs,使用KOBAS 3.0对DEPs进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。利用STRING及Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,利用cytoHubba插件及DEPs的度(Degree)值筛选出排名前35位的关键DEPs,并通过GluGO插件对35个关键DEPs所参与的生物过程进行分析。结果与假手术组相比,模型组大鼠漏尿点压力和最大膀胱容量明显增大(P<0.01);HE染色结果显示,模型组膀胱颈组织中出现炎细胞浸润,平滑肌壁增厚;模型组T10~L2脊髓组织出现神经元崩解,坏死后空洞形成,神经胶质细胞增生。TMT结果显示,在T10~L2脊髓组织中共筛选出了151个DEPs,其中84个蛋白上调、67个蛋白下调;KEGG分析发现151个DEPs,主要参与趋化因子信号通路、NOD-样受体信号通路、细胞坏死、细胞凋亡、多巴胺能神经突触和谷氨酸能突触等16条信号通路。35个关键DEPs主要参与了巨噬细胞活化、神经胶质细胞的激活、小胶质细胞的激活和神经炎症反应等生物过程。结论T10脊髓损伤后,T10~L2脊髓组织中C1qa、Clu、Snca、Pycard、Glul、Capn1、Ctsz和Ctsd可能是降低脊髓继发性损伤风险的潜在治疗靶点;T10~L2脊髓组织中多巴胺能突触和谷氨酸能突触信号途径可能成为治疗T10脊髓损伤后BND的新方向。

Orbitrap Exploris 480质谱在定量蛋白质组学应用中的优化和评测

基于数据依赖的扫描模式(data-dependent acquisition,DDA)和数据非依赖的扫描模式(data-independent acquisition,DIA)的非标记定量(label-free quantitative,LFQ)和同位素标记TMT(tandem mass tag)定量是蛋白质组学定量中较常见的技术.本文利用最新的Orbitrap Exploris 480质谱,优化了DDA、FAIMS DDA、FAIMS DIA的非标记定量方法以及TMT定量策略的关键质谱参数,并将其应用在人细胞蛋白质组、单细胞蛋白质组、血浆蛋白质组和酵母蛋白质组分析.结果表明,在DDA实验中,设置碰撞能量为27、二级谱图的分辨率为15 K、最大离子注入时间为22 ms是最佳的参数组合.针对极微量样品200 pg~5 ng,可以根据样品量相应设置最佳的质谱参数.使用200 pg和500 pg的HeLa细胞样品,分别鉴定到1259和1725个蛋白质,从而实现了单细胞蛋白质组学的深度覆盖.在FAIMS DDA实验中,60 min或90 min梯度时选择CV-45V的补偿电压,120 min或150 min梯度时选择CV-45V-65V补偿电压组合,可以获得最佳的蛋白质鉴定结果.从293T蛋白质组中分别在60、120和150 min中鉴定6300、6994和7500个蛋白质.在FAIMS DIA实验中,使用CV-45V-65V双补偿电压切换,60个隔离窗口来获得最佳的蛋白质鉴定数目和定量重现性.在60 min内分别在293T细胞和去除高峰度的血浆中定量到7019个细胞蛋白和1077个血浆蛋白.在TMT定量实验中设置APD开启、"Precursor Fit"阈值70和Turbo TMT功能的组合同时增加了TMT定量蛋白质的数量和TMT定量的准确性.在TMT11-plex标记的酵母蛋白质组中60 min即可定量10989个多肽和2162个蛋白质.综上所述,本研究中优化的多种非标记定量和TMT定量方法为Orbitrap Exploris 480在蛋白质组学更广泛的应用提供了参考.

宣白承气汤加味联合西药改善流感病毒与肺炎链球菌共感染小鼠肺炎作用机制

目的 基于TMT(tandem mass tag)标记定量蛋白质组学技术探究流感病毒/肺炎链球菌(IV/Spn)共感染肺炎小鼠的发病机制及中药复方宣白承气汤加味对其的改善作用。方法 选用幼龄健康雄性SPF级Balb/c小鼠40只,分别设置正常组、模型组、中药组、西药组、中西医结合组,每组8只。造膜成功后,分别给予小鼠宣白承气汤加味(0.15 g/mL)、奥司他韦(0.25 mg/mL)/头孢克洛干(0.48 g/mL)及中西药联合干预治疗,正常组与模型组予以等体积的生理盐水灌胃,7天后进行取材,分离各组小鼠肺部组织样品。所有样本经TMT 10标试剂进行标记定量、蛋白酶解、TMT肽段标记与肽段分级、LC-MS/MS分析后,用数据库检索方法确定差异蛋白,并进行生信分析。结果 与正常组比较,模型组小鼠的肺指数明显升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组小鼠肺指数明显降低(P<0.05,P<0.01),中药组、西药组及中西结合组的肺指数抑制率分别为68.66%、77.61%、85.07%。与正常组比较,IV/Spn共感染肺炎小鼠共导致259个蛋白的表达变化,涉及补体和凝血级联、氨基糖和核糖代谢、Fcγ介导的吞噬作用等信号通路;宣白承气汤加味干预后共涉及了13个蛋白的表达变化,主要富集于丙酸、丁酸、半乳糖代谢等通路;西药组干预后共涉97个蛋白的表达变化,主要富集于补体和凝血级联、氨基糖和核糖代谢、视黄酸诱导基因蛋白1样受体等通路;中西医结合组干预后共涉144个差异蛋白,主要富集于细胞外基质相互作用、小细胞肺癌、视黄酸诱导基因蛋白1样受体等通路。结论 小鼠肺脏组织中发生的免疫炎性反应是导致IV/Spn共感染肺炎发病的主要原因;宣白承气汤加味可以通过调节肠道菌群失调及物质能量代谢对IV/Spn共感染肺炎起到纠正作用;西药组可以通过免疫调控缓解IV/Spn共感染后的肺部炎症;中西医结合组可以在调节机体免疫、炎症反应的同时为机体提供物质能量。