基于TMT标记定量蛋白质组学技术研究中药复方益糖康改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制

目的研究db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的发病机制及中药复方益糖康对其的改善作用。方法9周龄健康雄性SPF级db/db小鼠16只、db/m小鼠8只,分别设置模型组、益糖康组、空白组,益糖康组使用30 g·kg^(-1)·d^(-1)的中医复方益糖康煎剂进行灌胃,其余两组予以等体积的生理盐水灌胃,5周后进行取材,分离各组小鼠的骨骼肌组织。所有样本经TMT 10标试剂进行标记定量、蛋白酶解、TMT肽段标记与肽段分级、LC-MS/MS分析后,用数据库检索方法确定差异蛋白,并进行生信分析。结果所选取的样本稳定,有较高的科学价值;与db/m正常小鼠相比,db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗总共导致Amd1、Serpina1e、Sorbs3、Fabp4、Myl3、Upf2等109个蛋白的表达变化,涉及了糖酵解、脂肪酸氧化、ATP的合成及供能等生物过程及PPAR、支链氨基酸代谢等信号通路;中药复方益糖康可以改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗,总共涉及了Pcolce、Pgk2、Trip11、Tmem41b、Mrps9、Bola2等49个蛋白的表达变化,通过调节三羧酸循环,乙醛酸和二羧酸代谢等通路实现;中药复方益糖康可以产生心血管受益,并能缓解由2型糖尿病及胰岛素抵抗导致的帕金森病、亨廷顿病。结论db/db小鼠是研究2型糖尿病及胰岛素抵抗的理想模型,TMT标记定量蛋白质组学技术可以精准发现相关差异蛋白,结果较权威;脾虚导致的骨骼肌线粒体功能障碍是2型糖尿病及胰岛素抵抗发病的原因之一;中药复方益糖康可以对2型糖尿病及胰岛素抵抗异常的生物过程起到纠正作用,与健脾修复线粒体损伤、促进线粒体自噬有关;整个实验过程筛选的差异蛋白及所涉及的生理病理变化是课题组下一步研究的重点。

顶坛花椒雌雄花芽发育的蛋白质组学特征

【目的】花椒果实(果皮)主要用作香料,同时也被用作传统中药。正常花椒以雌花为主,偶见雄花和两性花。近年来,位于贵州西南地区的顶坛花椒出现大量开雄花现象。雄花不是花椒结实的必需条件,已有研究认为该现象与生境退化有关。因此,研究顶坛花椒花芽发育过程中的蛋白质组学特征,对于从分子水平比较雌雄花芽发育差异,进而理解该物种对喀斯特生境的适应具有重要意义。【方法】采用TMT定量技术研究了顶坛花椒花序轴分化期花芽、雄花芽和雌花芽蛋白质组学特征。【结果】共检测到4 742个差异蛋白,与花序轴分化期花芽相比,雌花芽和雄花芽的上调差异蛋白主要参与的通路中,大部分相同。然而,核糖体通路仅显著参与雌花芽发育调控。与雌花芽相比,仅在雄花芽中出现的脂肪酸降解以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解通路可能有利于增强顶坛花椒对养分贫瘠的适应。挖掘到脂肪酰-CoA还原酶、含果胶裂解酶3结构域蛋白和α-半乳糖苷酶等9个差异蛋白与雄花发育特异相关,含核酸外切酶的结构域蛋白、含H15的结构域蛋白和腺嘌呤磷酸核糖转移酶等7个差异蛋白与雌花发育特异相关。【结论】顶坛花椒雌雄花芽发育过程具有显著不同的蛋白质组学调控机制,大量开雄花可节约资源,可能有利于植株对喀斯特生境的适应。

宣白承气汤加味联合西药改善流感病毒与肺炎链球菌共感染小鼠肺炎作用机制

目的 基于TMT(tandem mass tag)标记定量蛋白质组学技术探究流感病毒/肺炎链球菌(IV/Spn)共感染肺炎小鼠的发病机制及中药复方宣白承气汤加味对其的改善作用。方法 选用幼龄健康雄性SPF级Balb/c小鼠40只,分别设置正常组、模型组、中药组、西药组、中西医结合组,每组8只。造膜成功后,分别给予小鼠宣白承气汤加味(0.15 g/mL)、奥司他韦(0.25 mg/mL)/头孢克洛干(0.48 g/mL)及中西药联合干预治疗,正常组与模型组予以等体积的生理盐水灌胃,7天后进行取材,分离各组小鼠肺部组织样品。所有样本经TMT 10标试剂进行标记定量、蛋白酶解、TMT肽段标记与肽段分级、LC-MS/MS分析后,用数据库检索方法确定差异蛋白,并进行生信分析。结果 与正常组比较,模型组小鼠的肺指数明显升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组小鼠肺指数明显降低(P<0.05,P<0.01),中药组、西药组及中西结合组的肺指数抑制率分别为68.66%、77.61%、85.07%。与正常组比较,IV/Spn共感染肺炎小鼠共导致259个蛋白的表达变化,涉及补体和凝血级联、氨基糖和核糖代谢、Fcγ介导的吞噬作用等信号通路;宣白承气汤加味干预后共涉及了13个蛋白的表达变化,主要富集于丙酸、丁酸、半乳糖代谢等通路;西药组干预后共涉97个蛋白的表达变化,主要富集于补体和凝血级联、氨基糖和核糖代谢、视黄酸诱导基因蛋白1样受体等通路;中西医结合组干预后共涉144个差异蛋白,主要富集于细胞外基质相互作用、小细胞肺癌、视黄酸诱导基因蛋白1样受体等通路。结论 小鼠肺脏组织中发生的免疫炎性反应是导致IV/Spn共感染肺炎发病的主要原因;宣白承气汤加味可以通过调节肠道菌群失调及物质能量代谢对IV/Spn共感染肺炎起到纠正作用;西药组可以通过免疫调控缓解IV/Spn共感染后的肺部炎症;中西医结合组可以在调节机体免疫、炎症反应的同时为机体提供物质能量。

人皮肤成纤维细胞和脐带间充质干细胞分泌蛋白差异比较研究

该文探讨人皮肤成纤维细胞(NCF)和脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)分泌蛋白的差异,从而初步阐明脐带间充质干细胞分泌蛋白对于治疗退行性疾病的可能分子机理。基于串联质谱(LC-MS/MS)的方法,收集用无血清培养基培养48 h的NCF和hUC-MSCs上清样品,进行TMT(tandem mass tags for relative and absolute quantitation)检测,从而对蛋白质酶解之后的肽段进行同位素标记,之后对分泌蛋白的表达差异进行精确的鉴定和定量。通过生物信息学分析,建立NCF和hUC-MSCs分泌蛋白谱图,并通过GO(gene ontology)对这些分泌蛋白进行功能分析,对于在蛋白分子互作图中处于中心位置的CCL2、COL4A1、TGFβ1、SERPINE1、SEMA7A我们进行了Real-time PCR定量分析。通过TMT以及生物信息学分析,该文鉴定出1000多种共有蛋白,其中有704种蛋白在hUC-MSCs中的表达量比NCF中高。通过Real-time PCR,我们证实了CCL2、COL4A1在hUC-MSCs中的分泌量的确高于其在NCF中的分泌量,且差异具有显著性。通过检索文献以及Uniprot的相应数据库数据,该文发现,这两种分子在炎症的消除方面起到十分重要的作用,而炎症反应在帕金森病等退行性疾病的发生与发展过程中起到重要作用。通过对NCF和hUC-MSCs培养基中分泌的蛋白进行检测分析,该研究为探讨脐带间充质干细胞分泌蛋白治疗神经退行性疾病的可能分子机制提供启示。