Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响

目的探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用。方法分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞。转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。结果转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖最快,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖最慢,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2+S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖。

肝部分切除术后Tmub1蛋白与securin蛋白的相互作用研究

目的探讨肝部分切除术后Tmub1蛋白与securin蛋白的相互作用。方法 SD大鼠30只,随机分为肝切除术后0、24、48h组,每组10只。0h组行肝切除术后直接灌注肝脏并取原代肝细胞,后两组分别于术后24、48h灌注肝脏提取原代肝细胞。每组肝细胞中一部分行原代肝细胞培养,并通过免疫荧光及激光共聚焦实验检测Tmub1蛋白与securin蛋白的共定位情况;另外一部分肝细胞经裂解后提取蛋白,行免疫共沉淀及Western blotting检测Tmub1/securin共沉淀蛋白的表达。结果激光共聚焦实验结果显示,肝切除术后0h细胞核内几乎没有Tmub1和securin蛋白表达,术后24h及48h Tmub1与securin蛋白大量共定位于细胞核内;免疫共沉淀及Western blotting检测结果显示,术后0h Tmub1/securin蛋白条带较弱,术后24-48h明显增强（P〈0.01）,但24h与48h之间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 Tmub1在正常肝细胞中几乎不与securin结合,但在肝切除术后从胞质进入细胞核,与securin蛋白相互结合,从而抑制肝细胞的增殖。

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的构建Tmubl基因的过表达慢病毒载体（LV—Tmubl），为研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmubl基因序列，用BamHI／AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。PCR鉴定引物，再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析。使用构建的LV—Tmnbl，转染293T细胞，荧光法检测构建的慢病毒滴度。结果成功构建了LV-Tmubl，并获得相应的病毒，病毒滴度为2×10^8TU／mL。结论LV-Tmubl为进一步研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础。

大鼠肝再生过程中miR-27b与Tmub1表达相关性研究

目的探讨miR-27b与Tmub1在大鼠70%肝大部分切除术肝脏再生过程中的表达相关性。方法将SD雄性大鼠(180±20)g,随机分为实验组(肝部分切除术,partial hepatectomy,PH)和假手术组(剖腹探查手术,exploratory laparotomy),依次提取0、12、24、48及72 h原代肝细胞并留取组织标本,利用real-time PCR检测不同时间段肝脏内miR-27b与Tmub1 m RNA的量,并利用Western blot检测不同时间段肝脏内Tmub1蛋白含量,从而分析出miR-27b与Tmub1蛋白表达的时间相关性;将miR-27b模拟物转染入肝细胞,采用荧光素酶报告基因检测系统观察miR-27b对Tmub1表达的影响。结果肝切除12、24、48及72 h后PH组miR-27b表达较假手术组均显著下降(P<0.05),而该相同时相点Tmub1 m RNA及蛋白水平显著增高(P<0.05);改变miR-27b的表达后,含Tmub1基因序列的报告基因荧光素酶活性明显下降(P<0.05)。结论肝再生过程中miR-27b与Tmub1的表达呈负相关,miR-27b可能参与了Tmub1的表达调控过程。

Tmub1沉默提高Akt蛋白活性促进肝细胞增殖

目的探讨Tmub1沉默对Akt磷酸化和肝细胞增殖及生长能力的影响。方法应用RNAi技术对BRL-3A细胞株Tmub1基因进行沉默,采用qRT-PCR和Western blot分别检测Tmub1、Akt、p-Akt、Cyclin D1、c-myc等基因的mRNA和蛋白表达水平;采用平板集落形成实验和CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期。结果与对照组相比,Tmub1基因沉默后,Cyclin D1和c-myc基因mRNA表达增强(P<0.05),p-Akt磷酸化水平以及Cyclin D1和c-myc蛋白的表达增高(P<0.05);BRL-3A细胞的增殖及生长能力增强(P<0.05);且处于细胞周期S+G2/M期的细胞比例明显增加(P<0.05)。通过MK2206抑制Akt磷酸化后,可显著抑制上述基因的mRNA及蛋白的表达水平,细胞的增殖及生长能力明显降低(P<0.05),且处于S+G2/M期的细胞比例下降(P<0.05)。结论 Tmub1沉默通过增加Akt蛋白的磷酸化及Cyclin D1、c-myc的表达水平从而促进BRL-3A细胞的增殖和生长。

Tmub1沉默对大鼠肝部分切除术后肝细胞增殖的影响

目的探讨Tmub1蛋白在肝再生过程中的作用及其在肝再生过程中对Securin蛋白的影响。方法 54只大鼠随机分为3组即Tmub1 RNAi慢病毒组、空载慢病毒组及正常对照组,其中Tmub1 RNAi慢病毒组、空载慢病毒组注射相应病毒颗粒(3×107TU),对照组未行注射,2 d后行肝部分切除术(partial hepatectomy,PH),每组分为6个亚组:PH术后0、2、6、12、24、48 h,每亚组3只大鼠,术后提取原代肝细胞、留取肝脏组织标本,利用Real-time PCR和Western blot检测慢病毒干扰效果及Tmub1沉默后对Securin蛋白的影响。MTT实验、流式细胞仪检测原代肝细胞的增殖情况。结果Real-time PCR和Western blot表明实验组Tmub1 mRNA和蛋白被有效抑制;Tmub1沉默后securin mRNA表达无明显变化,而G2/M期securin蛋白量明显减少。MTT实验表明Tmub1沉默可明显上调PH术后6～24 h肝细胞的增殖速率;流式细胞分析结果显示实验组处于G2/M期的肝细胞比例明显增高。结论 Tmub1蛋白在肝再生过程中对肝细胞增殖进程发挥负向调控作用,而该作用可能与其在蛋白质水平影响了Securin的表达密切相关。

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A细胞Tmub1基因沉默及稳定感染细胞系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。