基于NF-κB信号通路的玉屏风散加味含药血清对RLE-6TN细胞炎症反应的影响

目的观察玉屏风散加味含药血清对大鼠肺上皮Ⅱ型细胞RLE-6TN炎症反应的影响,基于核因子(NF)-κB信号通路探讨其作用机制。方法采用脂多糖诱导RLE-6TN细胞炎症反应,将细胞分为对照组、模型组、地塞米松血清组和5%、10%、20%中药血清组,分别以不同血清干预细胞24 h。试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量,荧光染色检测细胞活性氧(ROS)含量,Hoechst/PI双染观察细胞凋亡情况,ELISA检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量,RT-qPCR检测细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA表达,Western blot检测细胞TLR4、MyD88、NF-κBp65、IκBα蛋白表达。结果与对照组比较,模型组RLE-6TN细胞上清液LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β及细胞ROS含量显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01),IκBαmRNA表达显著降低(P<0.01),p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα比值显著升高(P<0.01);与模型组比较,20%中药血清组和地塞米松血清组细胞RLE-6TN细胞上清液LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β及细胞ROS含量显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),TLR4、MyD88 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),IκBαmRNA表达显著升高(P<0.01),p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα比值显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论玉屏风散加味含药血清可减轻RLE-6TN细胞炎症反应,其机制可能与调控NF-κB信号通路有关。

抗CD3mAb诱导TN细胞向过渡型CD8单阳性细胞分化

本实验观察了在IL-7维持TN细胞生长的体外细胞培养系统中,抗CD 3 mAb对TN细胞分化的作用。发现抗CD 3 mAb在体外能诱导TN细胞分化产生CD 4^-CD 8^+及部分CD 4^(lo)CD 8^+细胞。由于多数CD 8^+细胞为TCRβ^-,故抗CD 3 mAb诱导产生的CD 4^-CD 8^+细胞是DN向DP分化的不成熟过渡状态细胞。抗TCR βmAb也能诱导CD 4^-CD 8^+细胞产生,但其诱导分化能力弱于抗CD3 mAb。在体外细胞培养条件下,抗CD 3mAb诱导的DN→DP转化伴有IL-2 Rα表达下调,并且IL-7诱导的TCRβ分子表达也受到抑制。当TN细胞在IL-7条件下培养3天后,抗CD 3 mAb便失去诱导TN细胞分化的能力,表明抗CD 3 mAb诱导的TN细胞分化可能是通过细胞表面pre-TCR复合体进行的。

Tn细胞凋亡抑制蛋白(TnIAP)在粉纹夜蛾细胞中的表达和活性研究

在粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)细胞Tn 5B1 4中 ,高效表达了来自粉纹夜蛾细胞Tn 5B1 4能够抑制细胞凋亡的TnIAP蛋白 .聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析表明 ,表达的重组TnIAP只有少部分是可溶性蛋白 ,大部分以不溶的形式存在 .这一结果与以往在昆虫细胞中往往表达出可溶性蛋白不同 .活性实验表明 ,可溶的重组TnIAP能够直接抑制caspase 9酶解Ac LEHD AFC的活性 ,也能抑制caspase 9激活HEK2 93细胞抽提物酶解Ac DEVD AFC的活性 .结果进一步证明 。

氰戊菊酯经Tn细胞代谢前后结构的变化

为了探讨昆虫细胞对氰戊菊酯产生抗性的分子机制,使用浓度为12.5μmol·L-1的氰戊菊酯处理Tn细胞,并对粉蚊夜蛾Tn细胞代谢后的氰戊菊酯及其衍生物进行回收纯化,采用核磁共振和质谱等手段检测氰戊菊酯被代谢前后的结构变化。氰戊菊酯经Tn细胞中代谢后,苯氧基被羟基所取代,α-氰基从被氢取代。结果表明Tn细胞通过对氰戊菊酯进行修饰,从而降低了氰戊菊酯的毒性。

氰戊菊酯对Tn细胞系P450及蛋白质谱表达的影响

研究氰戊菊酯对粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系细胞色素P450(P450s)的诱导作用及蛋白质谱表达的影响．用MTT法和台盼兰法观察不同浓度氰戊菊酯处理Tn细胞12 h后细胞的存活率；光谱测定法测定P450s含量；以12．5μmol/L氰戊菊酯处理Tn细胞12 h,通过二维液相色谱分离技术分析处理前后Tn细胞系蛋白质谱的变化．结果显示：当氰戊菊酯处理浓度高于17．5μmol/L时,Tn细胞形态发生明显变化,且细胞死亡率显著高于对照组(P＜0．01)．P450s的含量有随氰戊菊酯浓度增加而升高的趋势,并在氰戊菊酯浓度为12．5μmol/L时达到最高(8．562nmol/mg protein)；P450s的含量亦有随处理时间延长而升高的趋势,且在12 h时达到最高(5．28±1．14 nmol/mg protein)．通过二维液相色谱分离技术得到124个差异组分,其中42个组分上调,82个组分下调．结果表明：氰戊菊酯对P450s确有诱导作用,且氰戊菊酯诱导前后Tn细胞中蛋白的变化可能与P450s诱导途径中某些受体的变化有关．

协同刺激分子B7-1/2对日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响

目的 观察协同刺激分子B7 1 /2 (CD80 /CD86 )对日本血吸虫感染小鼠后Th1 /Th2细胞因子水平的影响 ,探讨B7 1 /2介导Th1 /Th2免疫偏移对控制血吸虫虫卵肉芽肿的作用。方法 取小鼠感染后 6、8、1 0和 1 2w的脾淋巴细胞用抗CD80mAb和抗CD86mAb处理后培养 72h ,用ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN γ和IL 4的表达水平的动态变化。结果 抗CD80mAb和抗CD86mAb对IFN γ的抑制作用不明显 ,但二者均能显著抑制IL 4的表达水平 ,尤其是抗CD86mAb对IL 4抑制作用非常显著。结论 通过干预B7∶CD2 8协同刺激途径可以调节Th1 /Th2细胞因子的表达水平 ,而且B7 2分子对Th2反应的影响作用大于B7 1分子。B7∶CD2 8协同刺激途径可以调节Th1 /Th2免疫偏移 。

氰戊菊酯对Trichoplusia ni细胞活力的影响

以不同浓度的氰戊菊酯处理昆虫细胞T richop lusia n i(T n),并用台盼兰染色、3-(4,5-D im ethy lth iazo l)-2,5-d ipheny ltrazo lium brom ide(M TT)还原试验及流式细胞仪检测等方法对T n细胞活力进行测定。结果显示,氰戊菊酯浓度大于17.5μm o l/L处理的T n细胞形态、活力均发生了明显改变。在台盼兰染色实验中,氰戊菊酯浓度≥17.5μm o l/L时,T n细胞死亡率升高到29.69%以上,极显著高于对照(P<0.01);在M TT还原实验中,当氰戊菊酯浓度≥17.5μm o l/L时,T n细胞对M TT试剂的还原物吸光值降低,细胞相对活力较对照极显著下降(P<0.01);用流式细胞仪检测的结果也证实,氰戊菊酯浓度为25μm o l/L时,死亡与凋亡细胞数明显高于对照。

联合免疫治疗对肝移植大鼠移植肝组织学和外周血Th1/Th2细胞因子的影响

目的用抗CD-40L单抗加小剂量CsA联合免疫治疗肝移植大鼠受体,观察其生存时间?移植肝组织学和Th1/Th2细胞因子谱的变化。方法建立大鼠肝移植模型后,将动物随机分为4组。A组为同基因移植组,SD→SD;B组为同种异体移植组,SD→Wistar,不用任何免疫抑制治疗措施;C组,SD→Wistar,采用CsA处理;D组,SD→Wistar,采用CsA加抗CD-40L(CD-154)单抗处理。观察各组肝移植受体生存期和移植肝病理变化;用ELISA法检测外周血细胞因子水平。结果A,D组均可长期存活,B,C组生存时间分别为(13.8±2.4)d,(29.8±4.1)d;B,C组病理组织切片见中/重度急性排斥反应,D组移植肝组织损伤程度显著减轻,A组基本无排斥反应。B组血清IL-2和IFN-γ高于其余各组(P<0.05),C,D组IL-4,IL-10水平较B组有所升高(但P>0.05),尤其D组IL-10表达水平显著高于B组(P<0.05)。结论联合免疫治疗可有效抑制其急性排斥反应,延长大鼠肝移植受体的生存时间。Th2类细胞因子IL-4和IL-10的高水平表达与诱导移植耐受、抑制排斥反应有重要关系,它有助于大鼠肝移植受体和移植肝的长期存活。

肝癌患者癌组织与外周血Th1/Th2细胞的监测及临床意义

目的 :为观察肝癌患者癌组织与外周血Th1 Th2细胞变化及临床意义。方法 :Th1 Th2细胞检测采用酶联免疫斑点法 (ELISPOT) ,细胞因子检测采用双抗体夹心ELISA法。结果 :肝癌患者癌组织与外周血Th1 Th2细胞比值明显降低 (P <0 0 5 ) ,其Th1型细胞表达IL 2、INF γ等细胞因子水平明显低于正常对照组 ;Th2型细胞表达IL 4、IL 10等细胞因子水平明显高于正常对照组。PHA和IL 12介导肝癌患者手术切除前和手术切除 3个月后外周血Th1型细胞表达IL 2、INF γ等细胞因子水平升高 ,Th2型细胞表达IL 4、IL 10等细胞因子水平明显下降。结论 :肝癌患者癌组织与外周血Th1 Th2细胞比值均明显降低 ,细胞因子表达失衡 ,肝癌患者存在免疫功能抑制 ,因此 ,在肝癌治疗过程中打破免疫抑制 ,纠正Th1

树突状细胞与哮喘

树突状细胞 (DC)是强有力的抗原提呈细胞 (APC) ,是机体免疫反应的始动者 ,它能激活初始T细胞 (naiveTcells) ,调节Th1/Th2反应 ,参与免疫应答。支气管哮喘是气道的一种慢性变态反应性炎症性疾病 ,存在免疫异常。DC作为APC可通过多种途径参与哮喘发病 ,本文将对近年来DC与哮喘关系的研究作一综述。

人磷酸二酯酶同工酶3A在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人磷酸二酯酶同工酶3A(HPDE3A)在Tn细胞中的表达。方法用重组HPDE3A杆状病毒感染昆虫Tn细胞进行蛋白表达,通过RTPCR,SDSPAGE和Westernblotting技术检测HPDE3A表达情况。结果重组杆状病毒在感染Tn细胞后形态变化明显,获得表达产物,RTPCR扩增结果证实了Tn细胞中HPDE3A的mRNA水平增高,Tn细胞能够表达出与HPDE3A多克隆抗体结合的蛋白,蛋白分子质量约为120kD。结论HPDE3A在昆虫杆状病毒表达系统中可以稳定表达,为进一步研究HPDE3A的生物学活性及筛选HPDE3A抑制剂奠定了基础。

Tn5细胞中单链抗体基因抗人重组质粒分子的表达分析

目的研究Tn5细胞中单抗抗人重组质粒（B7-2）基因的表达及其活性。方法基于具备信号肽单抗抗人B7-2构建,构建系统Bac-to-Bac并含单抗抗人B7-2杆状重组病毒AcBacmid单抗B7-2,对Tn5细胞采用不同感染复数（MOI）实施感染,进行24、48、72h不同时点细胞蛋白活性的分泌表达,并分析人外周血中单个核细胞受Raji刺激呈增殖表达,予以单抗抑制的效果。结果应用不同MOI对Tn5细胞感染,达72h后进行细胞收集,予以聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE-SDS）分析,其MOI为1-10表达目的蛋白的量,确定最佳MOI为5;MTT法下自动酶标仪波长570nm位置吸光度,其吸光值的大小同细胞PBMC增殖可呈正相关;各组吸光值显示细胞Raji刺激外周血单个核细胞（PBMC）呈增殖表达,单抗抗人B7-2可以抑制Raji细胞刺激PBMC出现的增殖效应。结论单抗B7-2抗原抗体相结合的活性,以及对PBMC产生的抑制效应均存在,但未见单抗B7-2效应明显表达,有待进行更进一步的试验研究。

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm在植物细胞和昆虫细胞内的定位

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm的细胞定位。【方法】将NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞。在激光共聚焦显微镜下观察NSm-GFP在烟草表皮细胞和昆虫Tn细胞中的定位情况。【结果】观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同,NSm-GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散,能够在细胞壁边缘定位,并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点,偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间;NSm蛋白在昆虫Tn细胞表面产生数量众多的管状结构并向外延伸。【结论】研究结果表明NSm能够特异性定位在植物细胞的胞间连丝处,并能在昆虫Tn细胞内表达,在细胞表面产生运动蛋白小管。

黄连素剂量依赖性抑制脂多糖刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞促凝和纤溶抑制因子的表达

目的探讨黄连素对脂多糖(LPS)刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子的影响。方法体外培养大鼠AECⅡ细胞株RLE-6TN,取对数生长期细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测黄连素对细胞的毒性作用,根据半数抑制浓度(IC50)确定药物浓度范围。将对数生长期细胞分为5组:空白对照组使用DMEM培养基常规培养;LPS组在培养基中加入5 mg/L的LPS刺激细胞;黄连素预处理组先分别加入20、50、80μmol/L黄连素预处理1 h后,再加入5 mg/L的LPS共培养。LPS刺激24 h后收集细胞,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)及实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的蛋白和mRNA表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中活化蛋白C(APC)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)及抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量。结果根据抑制率曲线计算得出黄连素对RLE-6TN细胞的IC50为81.16μmol/L,故选择20、50、80μmol/L作为黄连素的干预浓度。与空白对照组相比,LPS刺激24 h后RLE-6TN细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常,表现为TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显升高,TFPI的蛋白及mRNA表达水平明显降低;同时细胞上清液中APC、ATⅢ含量均明显降低,而PⅢP、TAT含量均明显升高。给予黄连素预处理后,LPS刺激诱导的RLE-6TN细胞表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子异常情况得到纠正,并呈现一定的剂量依赖性,以80μmol/L时作用更为显著;与LPS组相比,黄连素80μmol/L预处理组细胞中TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达水平均明显降低〔TF蛋白(TF/GAPDH):0.45±0.02比0.55±0.03,TF mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.39±0.08比1.48±0.11,PAI-1蛋白(PAI-1/GAPDH):0.37±0.02比0.64±0.04,PAI-1 mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.14±0.29比4.18±0.44,均P<0.01〕,TFPI蛋白及mRNA表达水平明显升高〔TFPI蛋白(TFPI/GAPDH):0.53±0.02比0.45±0.02,TFPI mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.94±0.08比0.40±0.05,均P<0.01〕;同时细胞上清液中APC、ATⅢ含量明显升高〔APC(μg/L):1358.5±26.0比994.2±23.1,ATⅢ(μg/L):118.0±7.4比84.4±2.7,均P<0.01〕,而PⅢP和TAT含量则均明显降低〔PⅢP(μg/L):11.2±0.4比18.6±0.9,TAT(ng/L):222.1±2.8比287.6±7.0,均P<0.01〕。结论黄连素可以剂量依赖性抑制LPS刺激下大鼠AECⅡ细胞促凝及纤溶抑制相关因子表达和分泌,促进抗凝因子表达和分泌,有望成为有效防治急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺泡过度促凝和纤溶抑制的新靶点。

氮杂胞苷对射线诱导大鼠Ⅱ型肺上皮细胞系上皮间质转换的影响

目的 探讨氮杂胞苷对射线诱导大鼠Ⅱ型肺上皮细胞系（RLE-6TN）上皮间质转换的影响,并探究其发生机制,为放射性肺纤维化提供潜在的药物治疗实验依据.方法 体外培养RLE-6TN细胞根据实验目的分为对照组（C）、照射组（R）、氮杂胞苷组（A）、照射加氮杂胞苷组（R＋A）.细胞超微结构改变采用透视电子显微镜鉴定,细胞形态学改变采用倒置相差显微镜观察.运用实时荧光定量RT-PCR检测E-cadherin和α-SMA在mRNA水平的表达,运用蛋白印迹法检测E-cadherin、GSK3β、p-GSK3β（ser9）在蛋白水平的表达.单因素方差分析组间差异.结果 R组细胞形态趋于纺锤形,而R＋A变化不明显.R组嗜锇性板层小体最终消失.RT-PCR提示在mRNA水平R组相对C组E-cadherin表达减少[（0.23±0.06）∶ （1.00±0.00）,P=0.002]、α-SMA表达增多[（2.91±0.01）∶（1.00±0.00）,P=0.000],而R＋A组相对R组E-cadherin表达增加[（0.47±0.05）∶（1.00±0.00）,P=0.024]、α-SMA表达减少[（2.50±0.02）∶（1.00±0.00）,P=0.037）].蛋白印迹法结果显示R组相对C组E-cadherin在蛋白水平表达下调[（0.07±0.01）：（0.48±0.02）,P=0.028]、p-GSK3β表达上调[（0.85±0.04）∶（0.23±0.03）,P=0.031],而R＋A组相对R组E-cadherin表达下降[（0.25±0.00）∶（0.07±0.01）,P=0.024）]、p-GSK3β表达上调程度明显减少[（0.39±0.03）∶（0.85 ±0.04）,P=0.014].结论 X射线可引起上皮细胞上皮间质转换,而氮杂胞苷通过抑制p-GSK3β活性来抑制放射诱导的RLE-6TN细胞上皮间质转换的发展.