利用转座子Tn917构建杀虫Bt工程菌

利用链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）的转座子Ｔｎ９１７衍生载体ｐＴＶ１Ｔｓ将苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）的２个杀虫晶体蛋白（ＩＣＰｓ）基因整合进Ｂｔ染色体上，转座频率达５９×１０－５．将对双翅目昆虫有毒效的ＩＣＰｓ基因ｃｒｙ１１Ａ和广谱溶细胞且对蚊子等有毒效的ｃｙｔ１Ａ基因分别克隆到ｐＴＶ１Ｔｓ上，用高压电激法转入对鳞翅目昆虫有毒效的库斯塔克亚种（Ｂｔｓｕｂｓｐｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ１菌株，分别筛选到在染色体基因组上整合进这２个基因的突变株ＨＴ２６和ＨＴ４５，整合基因均能在这２株工程菌中获得表达并形成正常的伴孢晶体．生物测定结果显示，表达的Ｃｒｙ１１Ａ和Ｃｙｔ１Ａ晶体蛋白有很高的杀虫活性，对库蚊三龄幼虫的ＬＣ５０分别为８３ｎｇ／ｍＬ和６４ｎｇ／ｍＬ，同时Ｃｙｔ１Ａ晶体蛋白对培养的昆虫细胞有较强的溶解作用．

转座子Tn917的DNA序列计算机分析

通过计算机分析转座子Ｔｎ９１７的全序列，详细阐述了其物理图谱、结构功能及其转录调节机制．Ｔｎ９１７的５个ＯＲＦｓ排列在同一条ＤＮＡ链上，且阅读方向都从左至右．ＯＲＦ１－３起始点的左侧翼排列有启动子序列和Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ序列．ＯＲＦ５（编码转座酶）和ＯＲＦ４（编码拆分酶）的转录方向是一致的，翻译也紧密偶联在一起．在ＯＲＦ３和ＯＲＦ４之间存在１个ｒｅｓ位点，与Ｔｎ３中的ｒｅｓ位点基本同源．翻译衰减的功能与ｒＲＮＡ甲基化酶（由ＯＲＦ２编码的、ｅｒｍ基因的产物）诱导有关，在这个结构基因的左侧翼有２００ｂｐ的前导区域编码一个具调控功能的３６个氨基酸组成的多肽（由ＯＲＦ１编码）．

利用转座子Tn917构建单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株

单核细胞增生李斯特菌菌膜形成相关基因和调控因子的分离和鉴定是阐明其菌膜形成分子机理的基础。利用原生质体转化这一方式,将带有转座子Tn917的质粒pTV1OK成功地转进了单核细胞增生李斯特菌。通过诱导Tn917转座,得到单核细胞增生李斯特菌Tn917插入突变库,转座率为10-7。经96孔细胞培养板筛选发现,菌株LM49形成菌膜能力明显大于野生型。该菌株在细胞培养板中培养4d后形成的紫色圆环的颜色明显深于野生型。用Tn917特异引物进行PCR扩增,结果显示只有以该突变株的DNA为模板才能得到相应大小的扩增产物,证实该菌株基因组中有Tn917插入。Tn917的插入使菌株LM49的菌膜形成能力增强。

转座因子Tn917随机诱变变形链球菌UA159

目的 :诱导转座因子Tn917随机插入变形链球菌UA15 9染色体 ,产生在不同位点突变的突变株库。方法 :用含转座因子Tn917的质粒pTV1 OK转化变形链球菌UA15 9,诱导转座因子发生转座后 ,产生大量的突变株。随机挑选 6株突变株 ,提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切 ,以质粒pTV1 OK的 4 .3kbKpnⅠ片段 (含Tn917部分序列 )为探针 ,做Southern杂交 ,以野生株为对照。结果 :野生株无杂交带 ,突变株均有且只有一条杂交带 ,且杂交带的位置不尽相同。结论 :转座因子Tn917可以单拷贝随机诱变变形链球菌野生株 ,产生在不同位点突变的突变株 ,是从基因水平研究变形链球菌的有效手段。

耐红霉素屎肠球菌耐药基因及其水平转移研究

目的研究我国临床分离高水平耐红霉素的屎肠球菌中红霉素耐药基因及其水平转移情况。方法采用PCR法检测红霉素耐药基因ermB和mef,转座子Tn917相关基因tnpA。采用质粒酶切图谱分析耐药菌同源性,采用固体培养基传递法和液体培养基传递法研究红霉素耐药基因水平转移情况。结果90株高水平红霉素耐药屎肠球菌中ermB基因阳性率为85.6%(77/90),mef基因均为阴性,15.6%(14/90)tnpA基因阳性的肠球菌中ermB基因均为阳性。质粒酶切图谱显示除来自同家医院的4株菌质粒酶切图谱相同外,其余菌株质粒酶切图谱差异明显。14.3%(11/77)菌株携带的ermB基因在屎肠球菌间可通过固体传递水平转移,2.6%(2/77)菌株携带的ermB基因在屎肠球菌间液体环境中水平转移。13株接合子经过PCR鉴定,ermB基因均为阳性,但tnpA基因皆为阴性。结论高水平耐红霉素的屎肠球菌ermB基因携带率较高,且该基因可在屎肠球菌间水平转移,可水平转移的ermB基因可能位于其它非Tn917转座子和/或接合性质粒上。14株屎肠球菌ermB基因可能存在于转座子Tn917内。这些菌株间大多没有同源性。

生防细菌NCD-2突变体构建及抑菌功能基因的防病作用

生防细菌NCD-2是一株枯草芽孢杆菌菌株,该菌株通过分泌抑菌肽而对棉花黄萎病病原菌和棉花立枯病病原菌起到抑制作用。本研究着重通过原生质体法与诱导转座方法,建立了携带转座子Tn917质粒pTV1对枯草芽孢杆菌NCD-2野生菌株的转化体系与转座子突变技术,获得1500多个转座子插入突变子。通过测定这些突变子对大丽轮枝菌的抑制作用,筛选到2个抗生作用丧失的抑菌功能缺失的突变子。室内盆栽试验结果表明这2个抑菌功能缺失突变子对棉花立枯病的防效显著低于野生菌株,说明NCD-2野生菌株产生的抑菌肽在该菌株防治棉花立枯病中起到主要作用,进而说明编码该抑菌肽的基因在该菌株防治棉花立枯病中具有重要作用。

食源性单核细胞增生李斯特菌四环素、红霉素耐药基因研究

研究了食源性单核细胞增生李斯特菌四环素、红霉素耐药基因的分布状况及和耐药表型的关系。采用微量肉汤稀释法对2005~2007年河北省疾病预防控制中心分离到的食源性单核细胞增生李斯特菌株进行四环素、红霉素药敏实验;应用PCR方法对实验菌株进行四环素耐药基因tet（M）、tet（S）、tet（L）、tet（K）、tet（B）、及与tet（M）基因关系密切的转座子Tn916、红霉素核糖体甲基化酶基因ermB、ermC、及与ermB基因关系密切的转座子Tn917检测,对阳性样本序列进行鉴定分析;应用血清学分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、及脂肪酸聚类分析方法分析四环素耐药菌株之间的相关性,确定基因型和多态性。结果表明,91株单核细胞增生李斯特菌四环素敏感77株、耐药14株;红霉素敏感89株、耐药2株,其中包含1株菌同时交叉耐药四环素和红霉素;14株四环素耐药株中含tet（M）基因的13株,在13株tet（M）基因阳性菌中,tet（M）位于Tn916转座子上的9株;1株同时交叉耐药四环素、红霉素菌同时携带tet（S）、ermB基因;ermC基因、转座子Tn917均为阴性;四环素、红霉素敏感株中未检测到上述任何耐药基因。14株四环素耐药菌株血清型分布以1/2a型为主（n=12）,部分菌株PFGE、脂肪酸分型完全一致。食源性单核细胞增生李斯特菌获得tet（M）基因是耐四环素的主要机制之一,具有水平传播耐药基因能力的接合型转座子Tn916与该菌四环素耐药播散有直接关系;ermB基因介导的核糖体靶位点改变存在食源性单核细胞增生李斯特菌红霉素耐药株中;PFGE基因型结合脂肪酸聚类分析能够用来分析菌株之间的相关性。

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium1301的转座诱变

本研究通过原生质体法、电击法和转座诱导方法,建立了携带转座子Tn917的质粒pTV1对野生巨大芽孢杆菌B1301菌株的转化体系与转座子突变技术,获得1000多个转座插入突变子。通过细胞分裂素生物测试法对这些突变子进行测定,筛选到2个突变子B1301-6与B1301-22。B1301-22突变子分泌的细胞分裂素比B1301有显著提高,而B1301-6突变子分必和细胞分裂比1301有显著降低。抑菌试验结果表明这2个细胞分裂素产量发生改变的突变子抑制率显著低于野生菌株,说明转座子Tn917的插入不仅使野生B1301菌株编码控制细胞分裂素产量的基因发生了改变,同时也改变了与编码抑菌功能相关的基因也受到了影响。

转座子随机突变芽孢杆菌的研究进展

近年来,随着功能基因组学的发展,转座子随机突变技术因操作简便易行而被广泛应用。某些具有随机转座特性的转座子及其衍生物,已成为发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具,其中转座子Tn917、Tn10及mariner类家族转座元件已被改造并成功应用于芽孢杆菌突变体库的构建及基因功能的研究中。本文介绍上述3种转座子的结构、转座特点及在芽孢杆菌中的应用,并分析了mariner类家族转座元件的优势及应用前景。

转座子917扦入枯草杆菌SacX基因的双重效应

转座子扦入最普通的效应是基因失活。可是在某些情况下，转座子能在其邻近位置以顺式激活基因的表达。我们前面描述了一种特座子（Ｔｎ９１７）扦入枯草杆菌ＳａｃＸＹ座位。ＳａｃＸ和ＳａｃＹ分别编码包括由蔗糖诱导的外酶（蔗糖６－果糖基转移酶）在内的一个负的和一个正的惆节子。本文的数据表明转座子（Ｔｎ９１７）扦入有两种效应：使ＳａｃＸ失活与提高ＳａｃＹ的转录。后一种效应包含了转座子内的一个或几个成分。

血浆凝集降低筛选金黄色葡萄球菌促凝相关基因

【背景】金黄色葡萄球菌是重要的致病菌,其中促凝聚是重要的致病机制之一,可能存在新的基因参与其中。【目的】通过采用血浆凝集降低方法筛选及鉴定促凝相关基因。【方法】利用转座子随机插入突变技术建立金黄色葡萄球菌转座子突变文库,采用动态比浊及试管凝集技术筛选凝集能力降低的突变株;应用抗性标记挽救法鉴定突变基因并应用生物信息学预测基因的功能。【结果】通过观察血浆凝集能力降低共计筛选到突变菌株82个。鉴定其中的76个突变菌株的转座子插入位点,涉及基因13个,包括报道的与促凝集有关基因4个(占筛选基因的30.8%)。【结论】从金黄色葡萄球菌凝集能力降低筛选与促凝集可能有关的基因,为金黄色葡萄球菌促凝集基因的筛选提供了新策略,同时为了解该菌促凝集过程提供了候选基因。

单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选

通过对功能和调控基因的研究,探讨单核细胞增生李斯特菌菌膜的形成机制,建立防治该细菌污染食品的方法。使用电转化的方法,将携带转座子Tn917的质粒pTV1-OK转化到单核细胞增生李斯特菌中,诱导转座,获得1 880个突变株,加上前期构建的突变株,使突变库增加到2 200株。使用96孔细胞培养板对随机挑选的1 000余株突变株进行菌膜培养,结晶紫染色后测OD595值。以此值作为菌膜形成量的筛选依据,最终挑选出菌膜形成能力变小的突变株8株,目标突变获得率约8‰。对筛选的菌膜形成量变小的突变株进行荧光显微观察,证实该8株突变株菌膜形成能力弱于野生菌株。通过PCR验证,这8株突变株的基因组中插入了Tn917,这可能是它们的表型发生变化的原因。