TNF相关凋亡诱导配体基因治疗小鼠肝细胞肿瘤

目的:探讨经化疗药物作用后的H22细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,观察TRAIL、纤黏连蛋白及内皮抑素的真核表达质粒pTRAIL,pCH510,pES联合化疗抑制小鼠肿瘤生长的作用。方法:pTRAIL转染BHK细胞后,加入分别经MMC,ADM,5-FU处理的H22细胞,MTT法检测pTRAIL对H22细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析H22细胞凋亡。在小鼠种植瘤体内注射MMC与pTRAIL,pCH510,pES,观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果:pTRAIL能抑制H22生长并诱导细胞凋亡,与MMC,ADM及5-FU联合,H22的凋亡百分数分别为28.1%(P<0.01),22.5%(P<0.01)及47%(P>0.05)。体内,MMC+pTRAIL+pES+pCH510联合能有效抑制肝细胞肿瘤生长,肿瘤生成率为37.5%。结论:MMC或ADM作用后的残存H22肿瘤细胞对pTRAIL敏感,MMC+pTRAIL+pES+pCH510具有协同抑瘤效应,能将小鼠肝细胞肿瘤抑制在组织学水平。

重组可溶性TRAIL的表达及其诱导A549和H460^(wt)细胞凋亡

目的:获得人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rsTRAIL)蛋白,并探讨其应用于非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的前景。方法:RT-PCR从外周血单核细胞(PBMCs)中获取目的基因片段,构建重组质粒PQE30-TRAIL并转化入大肠杆菌(E.coli)M15,IPTG诱导目的蛋白表达并经镍固定金属亲和层析纯化,MTT法检测细胞增殖情况,荧光显微镜观察H460wt细胞的形态学改变,流式细胞仪检测其凋亡率。结果:获得与GenBank中报道一致的TRAIL基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有TRAIL免疫原性、相对分子质量约为21000目的蛋白。Ni2+-NTAagarose纯化得到单一条带蛋白。rsTRAIL处理H460wt细胞24h后,细胞凋亡率为43.2%,顺铂可以增强rsTRAIL对A549细胞的杀伤作用。结论:获得了与天然TRAIL蛋白具有相同生物学活性的目的蛋白,该目的蛋白具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用,联合顺铂能够增强rsTRAIL对NSCLC的杀伤作用。

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子(hTERT)调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体,并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法:利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞,采用G418筛选获得阳性克隆;应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术(FCM)结合间接免疫荧光、RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果:经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论:成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体,并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

鼠源TRAIL真核表达质粒的构建及其抑瘤效应的初步观察

采用 RT- PCR自小鼠脾细胞 RNA中扩增出鼠 TRAIL 基因的全长 c DNA,利用 DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pc DNA3.1中获得重组质粒 p X1。经酶切鉴定及序列分析 ,表明成功构建 TRAIL 的真核表达质粒。通过直接肌肉内注射进行基因转染 ,p X1具有诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌生长的作用。表明 TRAIL

TRAILmRNA与胃癌凋亡关系的研究

目的检测肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)mRNA在胃癌中的表达及其与凋亡的关系。方法利用原位杂交技术检测67例胃腺癌及对应的正常胃黏膜中TRAILmRNA的表达,同时利用原位末端标记技术(TUNEL)检测癌组织中的凋亡指数(AI),并分析它们之间的关系。结果①TRAILmRNA在正常胃黏膜中阳性表达率为95.52%,高于癌组织中的阳性表达率52.24%(P<0.05);②胃癌组织中细胞凋亡指数为1.85±0.66;③TRAILmRNA阳性组与阴性组中凋亡指数分别为3.06±0.45、1.21±0.13,两组间存在着显著性差异(P<0.05);④TRAILmRNA与胃癌组织中的患者的年龄、性别、肿瘤直径、部位、大体分型、浸润深度及有无淋巴结转移无明显的关系(P>0.05);与肿瘤的分化程度有关,分化程度越低,TRAIL的表达率越低(P<0.05)。结论TRAIL可能在胃癌凋亡过程中起重要作用。

曲古抑菌素A增加人肝癌Bel7402细胞对TRAIL敏感度的实验

目的探讨曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)联合肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)对肝癌细胞Bel7402增殖凋亡的影响及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色法分别检测TSA、TRAIL及低浓度TSA联合TRAIL处理Bel7402细胞的生长抑制率;4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色法对药物联合处理后的细胞进行凋亡形态学观察;免疫细胞化学和Western blot技术观察药物联合作用后p65蛋白在细胞中表达和定位的变化。结果不同浓度TSA作用6、12和24 h对人肝癌Bel7402细胞的增殖没有明显抑制作用,而作用48 h后的细胞增殖抑制率明显升高,和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度TRAIL处理Bel7402细胞存活率没有明显改变;低浓度TSA(20 ng/ml)预处理能够增加Bel7402细胞对TRAIL治疗的敏感度,TSA预处理联合TRAIL(100ng/ml)作用细胞24 h后,细胞生存率为(57.1±5.4)%,和单独药物处理组及对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);DAPI染色显示TSA和TRAIL联合作用后Bel7402细胞有核凋亡出现。荧光显微镜观察证明单独应用TSA(200 ng/ml)或TRAIL(100 ng/ml)处理的细胞p65蛋白有部分核内移位,而两种药物联合应用导致p65蛋白表达量降低,并且发生明显的核内转移和集聚。结论低浓度TSA能够增加肝癌Bel7402细胞对TRAIL的敏感度;其机制可能是两种药物联合应用降低p65的表达和活性,从而诱导Bel7402细胞凋亡。

结肠癌术后辅助免疫疗法抑制肿瘤腹腔转移的免疫机制

目的探讨辅助免疫疗法促进小鼠腹腔巨噬细胞TRAIL表达,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤腹腔转移的免疫机制。方法用氟脲嘧啶(5-FU)治疗小鼠结肠癌转移模型,辅助免疫治疗,观察各组小鼠腹腔肿瘤生长情况,ELISA方法检测脾细胞培养物上清中分泌IFN-γ的水平,FSCA分析各组小鼠脾细胞内T淋巴细胞和NK细胞比例和腹腔巨噬细胞表面TRAIL的表达。结果化疗联合免疫治疗组小鼠腹腔未见肿瘤细胞生长,脾细胞内CD3+、CD4+、CD8+的T淋巴细胞和NK细胞比例明显增高,脾细胞培养物上清中分泌高水平IFN-γ,巨噬细胞表面诱导肿瘤细胞凋亡的TRAIL分子表达明显增强。结论结肠癌术后辅助性免疫治疗,能活化特异性CTL分泌IFN-γ,改善腹腔抗原提呈微环境,诱导肿瘤细胞凋亡,对化疗药物的敏感性显著增强,是有效抑制小鼠结肠癌腹腔转移的重要免疫机制。

人重组TNF相关凋亡诱导配体联合塞来昔布诱导胆囊癌细胞凋亡的作用研究

目的 于体外实验观察人重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（rhTRAIL）联合环氧化酶-2选择性抑制剂塞来昔布对胆囊癌的疗效，初步探讨产生疗效的机制。方法 用Western-blot法检测塞来昔布作用于胆囊癌细胞株后，抗凋亡蛋白c-FLIP和死亡受体DR4、DR5表达状况。rhTRAIL联合塞来昔布作用于胆囊癌细胞株SGC-996后，采用3种方法检测细胞凋亡状况：（1）细胞的相差显微镜观察；（2）caspase 3、7活性检测；（3）Annexin染色后凋亡细胞流式细胞仪检测。结果 塞来昔布可下调 SGC-996细胞c-FLIPs的表达，上调DR5的表达，且呈浓度、时间依赖性。rhTRAIL联合塞来昔布作用于胆囊癌细胞后，细胞凋亡水平明显高于单独用药组和对照组。结论 塞来昔布可通过下调c-FLIPs表达和上调DR5表达，显著增强rhTRAIL诱导胆囊癌SGC-996细胞凋亡的作用。

槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合中药槐耳清膏对肝癌细胞株HEPG2及肝癌耐阿霉素(ADM)细胞株(HEPG2-ADM)的作用。方法通过培养液中ADM的浓度梯度递增法筛选培养,建立肝癌细胞HEPG2-ADM耐药细胞株;TRAIL,TRAIL+ADM,TRAIL+槐耳清膏分别处理肝癌细胞株HEPG2、HEPG2-ADM及正常肝细胞株L02,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果联合用TRAIL(100 NG/L)和槐耳清膏(1.0 G/L)处理肝癌细胞株HEPG2-ADM及肝细胞株L02,MTT显示对前者增殖有明显抑制作用,而对后者无明显作用;流式细胞仪检测TRAIL联合槐耳清膏处理HEPG2、HEPG2-ADM,可诱导细胞凋亡,与其他组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论槐耳清膏可显著增强TRAIL对HEPG2及HEPG2-ADM的杀伤作用,而对正常胎肝细胞株L02杀伤作用轻微,TRAIL和槐耳清膏联合应用可望克服肿瘤细胞中存在的化学治疗药物耐药和TRAIL耐受问题。

肿瘤坏死因子相关配体与阿司匹林合用对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的 观察肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与阿司匹林合用对肝癌SMMC-7721细胞的作用。 方法 氨甲喋呤法检测SMMC-7721细胞存活分数;流式细胞仪检测SMMC-7721细胞的凋亡率和细胞周期;Western Blot法检测凋亡相关基因的表达。 结果 单用300 ng/ml TRAIL、3、10 mmol/L阿司匹林SMMC-7721细胞存活分数分别为82.76％、81.34％和71.29％,合用的存活分数分别为43.5％、37.8％。3、10 mmol/L阿司匹林与300 ng/ml TRAIL合用诱导的细胞凋亡率明显大于单用两药诱导的细胞凋亡率之和(单用300 ng/ml TRAIL、3 mmol/L和10 mmol/L阿司匹林凋亡率分别为21.25％、1.89％和6.08％,合用的凋亡率分别34.76％、38.56％)并使G0/G1期细胞增加;3、10 mmol/L的阿司匹林使SMMC-7721细胞Bcl-2的表达明显减弱,但对Bax的表达无影响。 结论TRAIL与阿司匹林合用对肝癌SMMC-7721细胞有明显的协同杀伤作用,其机制可能与阿司匹林抑制Bcl-2的表达有关。

抑制PI3K-Akt通路逆转LMP1诱导的鼻咽癌细胞TRAIL抵抗

目的:在鼻咽癌细胞株中检测阻断PI3K-Akt信号通路对EB病毒膜潜伏蛋白1(LMP1)诱导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抵抗的作用。方法:运用Western blot检测LMP1过表达后Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表达改变;选用PI3K特异性抑制剂LY294002抑制PI3K-Akt信号通路后,MTT及流式细胞术观测CNE-1、CNE-1-LMP1对TRAIL敏感性的改变;Western blot检测细胞外信号通路的激活情况。结果:CNE-1-LMP1细胞p-Akt蛋白表达明显高于CNE-1细胞。1μmol/ml LY294002预处理8h后的CNE-1和CNE-1-LMP1细胞中p-Akt的表达明显降低,且2种细胞间p-Akt的表达差异无统计学意义(P>0.05)。MTT及流式细胞术结果显示LY294002预处理后,CNE-1-LMP1细胞对TRAIL的敏感性明显提高,达到CNE-1细胞的水平。结论:LMP1是通过激活PI3K-Akt信号通路诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗,提示针对PI3K-Akt信号通路的鼻咽癌靶向治疗方案可能逆转LMP1诱导的TRAIL抵抗。

P13K／mTOR双靶点抑制剂PI-103与TRAIL联合应用对喉鳞癌Hep-2细胞的作用

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶（P13K）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）双靶点抑制剂PI-103与肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）联合应用对喉鳞癌Hep-2细胞的作用。方法将喉癌Hep-2细胞分为7组，分别为P13K抑制剂LY294002组、mTOR抑制分子雷帕霉素组、P13K／mTOR双靶点抑制剂PI-103组、LY294002＋TRAIL组、雷帕霉素＋TRAIL组、PI-103＋TRAIL组和阴性对照组，以流式细胞仪检测各组Hep-2细胞周期及凋亡率。设立PI-103组、PI-103＋TRAIL组和阴性对照组，Transwell检测各组对Hep．2细胞迁移及侵袭能力影响，Western印迹法检测各组细胞中细胞凋亡及P13K／蛋白激酶B（AKT）／mTOR信号通路相关蛋白的表达水平。结果PI-103＋TRAIL组能够阻滞细胞周期于s期[G1：（1．80±0．30）％；G2：0．00]，相比其他各组能显著抑制细胞分裂，增强细胞凋亡[（66．78±2．93）％]（均P〈0．05）。PI-103＋TRAIL组细胞迁移数和侵袭数分别为（17．0±3．4）个和（18．4±5．4）个，PI．103组为（41．2±3．8）个和（41．6±4．7）个，联合用药组可显著降低细胞迁移及侵袭能力（均P〈0．05）。与对照组相比，PI．103处理组、PI-103＋TRAIL处理组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9、8、3的表达量逐渐升高，细胞周期蛋白（Cyclin）D1、CyclinE1、p-AKT、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E—BP1）的表达量逐渐降低（均P〈0．05）。结论PI-103与TRAIL联合应用于喉鳞癌Hep-2细胞能显著增强抗瘤效果，有望应用于喉鳞癌的治疗。

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体与放化疗联用对喉癌细胞的协同杀伤效应及机制

目的探讨人喉癌Hep-2细胞对肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（tumor necrosis factor—related apoptosis—inducing ligand，TRAIL）诱导凋亡的敏感性，TRAIL与顺铂、紫杉醇、放射线联合应用对Hep-2细胞的杀伤效应及其调控机制。方法采用活细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）法检测TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率以及caspase-8、caspase-9抑制剂对其作用的影响；流式细胞仪检测Hep-2细胞凋亡率及TRAIL受体表达量；蛋白质印迹法检测联合用药后caspase-8、caspase-9、caspase-3及TRAIL受体表达变化。结果TRAIL对Hep-2细胞的24h半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为596．92μg／L；顺铂、紫杉醇、放射线分别与TRAIL联合应用时Hep-2细胞凋亡率显著高于单药应用（P值均〈0．05）；caspase-9抑制剂Z—LETD—FMK使TRAIL、顺铂、紫杉醇对Hep-2细胞的生长抑制率显著下降（P值均〈O：05）；联合用药组caspase-8、caspase-9表达量显著升高，TRAIL死亡受体（DR4，DR5）表达量显著上调（P值均〈0．05）。结论人喉癌Hep-2细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡不敏感，TRAIL通过内源性途径诱导Hep-2细胞凋亡；TRAIL死亡受体的表达上调可能增强了Hep-2细胞对TRAIL的敏感性，可能是联合用药对Hep-2细胞发挥协同效应的重要机制。

重组变构型人TRAIL对肺癌细胞凋亡的诱导作用及其机制探讨

目的 :观察重组变构型人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(recombinant mutant human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,rmh TRAIL)对人肺癌A549细胞株的凋亡诱导作用,验证与此凋亡相关的差异蛋白质表达谱。方法 :A549细胞经rmh TRAIL处理后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,FCM法检测细胞周期及细胞凋亡变化。采用液相色谱串联质谱(liquid chromatograph-tandem mass spectrometer,LC-MS/MS)鉴定技术对rmh TRAIL作用前后A549细胞的蛋白质组学进行对比分析,寻找差异表达明显的凋亡相关蛋白,然后用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证相关基因的表达水平。结果 :不同质量浓度的rmh TRAIL处理A549细胞24 h后,细胞增殖抑制率均显著提高(P值均<0.05),半数抑制浓度为(9.5±3.9)×105 ng/m L。5×105 ng/m L rmh TRAIL处理24 h可诱导A549细胞凋亡,早期凋亡率明显升高(P<0.01)。rmh TRAIL对细胞周期无明显影响。rmh TRAIL作用后,A549细胞中肿瘤坏死因子受体超家族成员10B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B,TNFRSF10B)和TNFRSF10D表达水平分别下调至21.3%和31.8%,细胞FLICE抑制蛋白(cellular FLICEinhibitory protein,c-FLIP)表达水平上调至2.867倍。实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测结果证实,用药后作为TNFRSF成员之一的小分子死亡受体5(death receptor-5,DR5)的m RNA和蛋白表达均明显下调(P值均<0.05),而c-FLIP m RNA和蛋白表达则明显上调(P值均<0.05)。结论 :rmh TRAIL可诱导A549细胞凋亡,其原因可能与DR5表达下调及c-FLIP表达上调有关。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对Omi／HtrA2不同表达水平前列腺癌细胞的促凋亡作用

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对前列腺癌细胞（PC-3M）不同丝氨酸蛋白酶Omi／HtrA2表达水平的促凋亡作用。方法构建其小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，辅助设计Omi／HtrA2特异性siRNA序列。合成后克隆入真核表达载体psiRNA—hH1 neo。脂质体法转染psiRNA-Omi／HtrA2载体至PC-3M中，检测Omi／HtrA2在PC-3M细胞中的表达及psiRNA-Omi／HtrA2对Omi／HtrA2沉默效应后的转录和表达。用原位末端转移酶标记技术检测Omi／HtrA2基因沉默后，计算不同浓度TRAIL（50、100、200、500μg／L）下PC-3M细胞凋亡指数（AI）。结果Omi／HtrA2在PC-3M细胞中高表达。酶切和DNA测序证实siRNA基因序列正确，且准确克隆人psiR—NA—hH1neo载体中。psiRNA—Omi／HtrA2载体可特异性抑制PC．3M细胞中Omi／HtrA2的表达。不同浓度TRAIL（50、100、200、500斗g／L）对转染psiRNA-Omi／HtrA2载体后PC．3M细胞A1分别为7．23、14．87、22．65、31．78。而未转染组分别为15．28、24．17、36．33、47．76。两组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Omi／HtrA2在前列腺癌细胞凋亡过程中起重要作用，TRAIL促进前列腺癌细胞的凋亡，其效果与TRAIL浓度及Omi／HtrA2表达水平相关。

TRAIL及其受体在非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体TRAIL-R2和TRAIL-R4在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其意义.方法 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测79例NSCLC患者与80例正常人血清中TRAIL的表达水平,采用免疫组织化学法检测42例NSCLC组织及配对癌旁正常组织中TRAIL-R2和TRAIL-R4的表达水平.分析TRAIL、TRAIL-R2、TRAIL-R4与NSCLC患者临床病理特征的关系.结果 TRAIL在NSCLC患者血清中的表达明显低于正常人[（994.3±293.0） ng/ml∶（1 141.7 ±266.1） ng/ml],差异具有统计学意义（t=3.29,P=0.00）.TRAIL的表达与NSCLC患者的临床分期（F=2.28,P=0.00）、分化程度（t=5.76,P=0.00）相关.TRAIL-R2在NSCLC组织中的阳性表达率为73.8％ （31/42）,明显低于正常组织中的阳性表达率100.0％ （42/42）（x2=3.88,P=0.05）,TRAIL-R2的表达与NSCLC患者的临床分期（x2=27.89,P=0.00）、分化程度（x2=9.50,P=0.00）相关.TRAIL-R4在NSCLC组织中的阳性表达率为81.0％ （34/42）,明显高于正常组织中的阳性表达率50.0％（21/42）（x2=7.34,P=0.01）,TRAIL-R4的表达与NSCLC患者的临床分期（x2=17.82,P=0.00）、分化程度（x2=4.47,P=0.03）相关.在NSCLC组织中,TRAIL-R4与TRAIL-R2的表达呈负相关（r=-0.67,P=0.01）.结论 在NSCLC中,TRAIL、TRAIL-R2表达减少,TRAIL-R4表达增多,三者可能促进了NSCLC的发生发展,可为NSCLC临床治疗提供靶点.