PLNCX-TNFα基因转染对人胆管癌细胞生长的影响

目的 研究 L NCX- TNFα基因过表达对人胆管癌细胞的作用。方法 构建 L NCX- TNFα复合体 ,培养人胆管癌细胞 ,L NCX- TNFα转染人胆管癌细胞 ,得到稳定表达 ,通过聚合酶链式反应 (PCR)、流式细胞仪 (FCM)、免疫组织化学等方法检测基因表达、细胞生长增殖和细胞凋亡等情况。结果 重组体 L NCX- TNFα基因转染人胆管癌细胞后 ,能抑制细胞的生长和集落形成 ;流式细胞技术证实 ,L NCX- TNFα能诱导细胞发生凋亡并导致其发生 G1 期阻滞 ,G2 - M期和 S期比例明显下降 ,凋亡细胞数也明显增加。结论 TNFα基因通过诱导肿瘤细胞发生凋亡并导致其发生 G1 期阻滞在肿瘤基因治疗方面发挥作用。

瘤内直接注射TNFα基因对人肝癌裸鼠模型的抗瘤效应及其可能机制的初步研究

将L-tnfSN DNA用脂质体介导或磷酸钙沉淀法导入由SMMC7721细胞形成的裸鼠皮下瘤结，或者将含L-tnfSN DNA的逆转录病毒病毒颗粒直接导入皮下结节中。其后，测定外周血TNFα的水平，发现三种方法处理后均有TNFα的一过性的表达，但病毒颗粒直接注射法转导的TNFα基因表达高于其他两种方法(脂质体法次之，磷酸钙法最低）。

人TNFα基因转染的人肝癌细胞稳定高表达细胞克隆SMMC7721-TNF的建立及其部分生物学特性的初步观察

用重组逆转录病毒载体L-tnfSN的包装病毒颗粒感染人肝癌细胞SMMC7721，G418筛选后，随机挑选10个细胞克隆，扩大培养，检测细胞培养液上清中TNFα的水平，将其中表达TNF最高细胞克隆命名为SMMC7721-TNF。观察SMMC7721-TNF的分子生物学特性。Southern Blot证明TNFα基因完整地整合在细胞基因组中，

TNFα基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

如同联合应用两种具有协同作用的细胞因子可以达到更佳的免疫治疗效果一样，如果将两种具有协同作用的细胞因子基因共转染人一种肿瘤细胞内，此肿瘤细胞可能会具有更佳的抗肿瘤效果。IL-2和TNFα具有协同抗肿瘤作用和免疫调节作用。因此，本文选用IL-2基因和TNFα基因为共转染的目的基因，通过两步基因转移共转染人B16黑色素瘤细胞，观察了体内致瘤性和瘤苗效果。

TNFα基因转染的肿瘤细胞抗肿瘤转移作用的探讨

肿瘤瘤苗进行的主动性免疫治疗是一条较为理想的治疗途径，近几年发展起来的细胞因子基因转染的肿瘤细胞瘤苗，开创了肿瘤主动免疫治疗的新时代。肿瘤细胞靶向的TNFα基因治疗开展得较早，TNFα基因转染的肿瘤细胞的体内致瘤性显著下降，但是对于此肿瘤细胞制备成瘤苗对已发生的肿瘤能否具有抗肿瘤转移作用尚未见报道。

IL2-TNFα基因诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的 为深入进行胶质瘤细胞凋亡的分子生物学研究及为提高胶质瘤辅助免疫治疗打下基础。方法 通过光镜、电镜、荧光显微镜分析 ,DNA断裂分析及流式细胞仪分析 ,进行通过IL2 TNFα诱导C6胶质瘤细胞凋亡研究。结果 本研究用脂质体将pLXSN IL2 TNFα基因导入病毒包装细胞PA31 7,经G41 8抗性筛选 ,用NIH3T3细胞测得病毒滴度为 5×1 0 5CFU ml的细胞克隆 ,利用病毒上清感染C6细胞 ,测得IL2的生物活性为 2 0～ 8 0U 1 0 6 cells 2 4h ,测得TNFα生物活性为 3～ 1 1 0U 1 0 6 cells 2 4h ,实验证实在作用 72h后 ,C6细胞出现细胞凋亡 ;光镜和电镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩 ,染色质浓集贴边 ;流式细胞仪结果显示有凋亡峰出现 ,凋亡细胞占细胞总数 1 4 0 %± 1 3% ;荧光显微镜观察出现染色质浓集、断裂 ;DNA电泳表现出DNA呈梯状带断裂。结论 上述结果提示用IL2 TNFα成功诱导大鼠C6胶质瘤细胞发生凋亡。

造血干细胞移植供者TNF-α基因多态性在GVHD中的频率分析

探讨供者肿瘤坏死因子α(TNF α)基因多态性在重度急性移植物抗宿主病 (aGVHD)和广泛型慢性移植物抗宿主病 (cGVHD)中的作用。本研究应用变性高效液相色谱结合DNA测序检测了TNF α 30 8和TNF α 2 38基因在重度aGVHD和广泛型cGVHD的分布。结果表明 ,2 1例Ⅲ度 /Ⅳ度aGVHD病人中有 8例呈现TNF α 30 8(G/A)阳性 ,而2 8例 0度 /Ⅰ度aGVHD病人中仅 1例呈现TNF α 30 8(G/A)阳性 ,提示TNF α 30 8(G/A)在Ⅲ度 /Ⅳ度aGVHD中的频率明显高于 0度 /Ⅰ度aGVHD的病人 (P <0 .0 1)。在 2 3例广泛性cGVHD病人中有 7例呈现TNF α 30 8(G/A)阳性 ,而17例未发生cGVHD的病人中仅 1例呈现TNF α 30 8(G/A)阳性 ,提示TNF α 30 8(G/A)在广泛性cGVHD中的频率高于未发生cGVHD的病人 (P <0 .0 5 )。在 2 1例Ⅲ度 /Ⅳ度aGVHD和 2 8例 0度 /Ⅰ度aGVHD及 2 3例广泛性cGVHD及17例未发生cGVHD的病人中均有 1例呈现TNF α 2 38(G/A)阳性 ,提示TNF α 2 38(G/A)在上述各组病人间的频率无明显差异。结论 :TNF α 30 8(G/A)阳性与Ⅲ度

原发性肝癌基因治疗研究—含人TNF基因重组逆转录病毒转移系统的构建与表达

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载体ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞ＦｌｙＡ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。

含人TNF-α基因的重组逆转录病毒载体的构建、包装及对人肝癌细胞的感染

利用逆转录病毒载体LN系列的三种载体LXSN，LNCX和LNSX构建了插入TNFα基因的重组逆转录病毒载体L-tnfSN，LNC-tnf和LNS-tnf．重组载体用磷酸钙沉淀法引入病毒包装细胞PA317，经G418筛选后，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，结果表明L-tnfSN产生的病毒滴度最高(1×10^5CFU／ml)，

TNFα基因在小鼠成纤维细胞L929中的调控研究

质粒pEGFP 1是一种不含启动子序列的哺乳动物细胞表达载体 .将系列缺失的TNFα基因启动子、5′UTR(untranslatedregion)和 3′UTR插入 pEGFP 1中 ,构建了一组重组质粒 .转染L92 9细胞后 ,发现当报告基因EGFP的上游含有包括 5′UTR在内的TNFα基因启动子序列时 ,重组质粒在L92 9细胞中均能表达EGFP .但是 ,当EGFP基因 3′端同时含有TNFα基因的 3′UTR时 ,重组质粒转染L92 9细胞后 ,均不能表达EGFP .因此 ,在L92 9细胞中 ,TNFα基因的 3′UTR对基因表达具有抑制作用 .进一步研究发现 ,在L92 9细胞中 ,TNFα基因的 3′UTR对基因表达的抑制作用需要其 5′UTR的共同参与 ,而且 ,RT PCR实验表明 ,LPS在其他细胞中对TNFα表达起诱导作用的机制在L92

外源p53基因和TNFa基因转导对膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长抑制

通过逆转录病毒载体将野生型ｐ５３基因、ＴＮＦａ基因单独或与ＩＬ－６基因连接（ＴＮＦＩＬ－６）分别导入膀胱癌细胞株ＥＪ和ＢＩＵ－８７．裸鼠致瘤试验和体外生长实验显示：ｐ５３基因转染组细胞接种裸鼠后９周无肿瘤生长，体外生长速率明显降低，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示Ｈ－ｒａｓ基因表达明显低于非转染组细胞，ＴＮＰａ基因和ＴＮ刊ＩＬ－６基因转染组裸鼠瘤体积明显小于对照组，体外生长速率与对照组无显著差别，两种细胞因子对Ｈ－ｒａｓ基因表达无影响。

实时荧光定量RT-PCR法检测TNF-α mRNA基因表达

目的建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription po lym erase cha in reaction,RT-PCR)法检测TNF-α基因mRNA表达。方法用T-A克隆技术构建含TNF基因的载体作为标准模板,采用荧光T aqm an方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测肿瘤患者与正常人外周血单个核细胞的TNF-αmRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测肿瘤患者外周血单个核细胞TNF-αmRNA表达明显高于正常人,且半定量RT-PCR结果显示TNF-α出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测TNF-αmRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。

花鲈肿瘤坏死因子基因及其在LPS和病毒刺激下表达的研究

采用同源克隆和锚定PCR技术，从花鲈(Lateolabrax Japonicus)中克隆到肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNFα)cDNA的全序列。花鲈TNFα的cDNA全长990bp，3′非编码区域(UTR)为192bp，5′UTR为72bp，开放阅读框(ORF)为723bp，可编码241个氨基酸，分子量大约为26kDa。同源性分析表明该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的TNFα基因具有很高的相似性，并含有TNF家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对不同刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行了初步研究，发现TNFα基因在未受刺激鱼体的头肾和脾脏中有明显的表达。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和虹彩病毒(Iridovirus)都可以诱导TNFα基因高水平的表达，但是在不同组织内的表达存在差异。LPS刺激后表达较强的组织是头肾和睥脏，而病毒感染后TNFα在盱脏中的表达较强。研究结果表明花鲈TNFα基因存在组成型和诱导型两种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。

肿瘤坏死因子-α基因启动子-850位多态性与强直性脊柱炎相关性研究(病人和13个家族调查)

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因启动子-850位点多态性对强直性脊柱炎(AS)易感性和临床表现的影响。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对33名AS患者、13个家庭的AS患者一级亲属39名以及187名正常对照者的TNF-α基因启动子-850位点进行基因分型,并分析基因型与疾病临床表现之间的关系。结果经病例-对照研究,TT基因型在AS组中的分布显著高于正常对照组(15.2%vs2.1%,P<0.01);T等位基因携带者在AS组与正常对照组间分布存在显著差异(75.8%vs21.4%,P<0.01);家庭调查也发现在AS一级亲属中T等位基因携带者显著高于正常对照组(64.1%vs21.4%,P<0.01);TX(CT+TT)基因型与CC基因型的AS患者在病程、临床症状、B27阳性率方面无明显差异;CT分级方面,TX基因型AS患者的骶髂关节CT分级≥Ⅲ级者的比例较CC基因型AS患者高(60%vs37.5%,P>0.05);但在ESR、CRP方面,TX基因型AS患者较CC基因型AS患者明显升高(分别为80%vs37.5%;56%vs12.5%。P<0.05)。结论TNF-α基因启动子-850C→T的突变可能是AS发生的新易感基因。与AS的炎症严重程度也可能存在关联。

肿瘤坏死因子α基因多态性与肺结核性慢性阻塞性肺病的关系研究

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)基因-308G→A多态性与中国汉族人肺结核性慢性阻塞性肺病(COPD)的相关性。方法采用病例对照研究方法,应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP技术,检测患有肺结核及合并COPD患者106例和健康对照者108例TNFα基因启动子-308G→A多态性,对其易感性进行分析,同时检测血清TNFα含量。结果肺结核组及合并COPD组TNFα基因GA杂合子共29人,基因型频率分别为22.7%、30.6%,分别与对照组(11.1%)相比明显升高。肺结核组及COPD组TNFαA等位基因频率分别为0.114、0.153,显著高于对照组(0.056),差异有显著性(χ2=4.82,P<0.05及χ2=6.78,P<0.01)。携带TNFαA等位基因的COPD个体比不携带此等位基因的COPD个体发生COPD的危险性增加近5倍,RR=5.96(95%CI 0.95,～7.85)。在肺结核性合并COPD患者,治疗前TNF浕含量明显高于治疗后,携带TNFαA等位基因者比非携带TNFαA等位基因者TNF浕含量明显升高,有差异极显著性(P<0.01)。结论TNFα基因-308G→A多态性与COPD的易感性相关,携带TNFαA等位基因者,可增加肺结核感染者发生COPD的危险性。

IL-6表达增高及TNFα下调参与bcl-2反义寡脱氧核苷酸诱导的细胞凋亡的调控

目的 探讨 bcl- 2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (antisense phosphorothioateoligodeoxynucleotide,AS- PS- ODN)诱导细胞凋亡的调控机理。方法 合成 bcl- 2 AS- PS- ODN作用于小细胞肺癌细胞株 NCI- H44 6 ,流式细胞仪 DNA倍体分析和脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡 ;多重半定量逆转录 -聚合酶链反应检测 bcl- 2 AS- PS- ODN处理前后 bcl- 2、c- myc、survivin、bax、s10 0 A2 、TNFα、TGFβ1及 IL- 6等基因 m RNA表达的变化。结果 bcl- 2 AS- PS- ODN能够诱导 NCI-H44 6细胞凋亡 ,随着 bcl- 2 m RNA水平的下降 ,IL- 6表达增高 72 .71% (P<0 .0 5 ) ,TNFα表达下调6 5 .90 % (P<0 .0 5 ) ,而 c- myc、survivin、bax、s10 0 A2 、TGFβ1等基因的表达无明显变化。结论 IL- 6表达增高及 TNFα下调参与 bcl- 2反义寡脱氧核苷酸所诱导的细胞凋亡的调控。