人TNFβ缺失体融合表达及其产物一步纯化法研究

本文将hTNFβN端缺失 2 3aa的缺失体基因克隆于 pET 2 8 C(+ ) 表达载体 ,构建成T7lac启动子控制下His6 TNFβ融合表达质粒 ,转化到E coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,His6 TNFβ表达量约占总菌体蛋白的 2 5 % ,Mr2 0 5 0 0。表达产物大部分以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤 ,70mol/L脲变性溶解 ,用Ni2 + 亲和层析一步快速纯化 ,所得His6 TNFβ的纯度达 90 %以上 ,回收率在 90 %左右。纯化产物稀释复性后 ,其细胞毒活性为 (0 5～ 1 0 )× 10 6U/mg蛋白左右。这些研究结果将为制备重组人TNFβ缺失体以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。

TNFβ的基因多态性在汉族SLE病人中的分布特点及与其他不同种族人群的比较

ＴＮＦβ的基因多态性在汉族ＳＬＥ病人中的分布特点及与其他不同种族人群的比较王育新章友康朱世乐刘玉春白千帆郑欣（北京医科大学第一医院肾内科，北京１０００３４）系统性红斑狼疮（ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，ＳＬＥ）是一种较为常见...

人His6-IFNγ/TNFβ(His6γ-TNFNβ)融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究

应用pET28(含T_7lac启动子和His6-tag)质粒,将人γTNFβ融合基因与之组建成pETγLT表达质粒,并转化于E.coliBL21(DE3).本文对pETγLT/ BL21(DE3)工程菌的His6-γTNFβ重组产物进行了诱导表达,分离纯化的研究.结果表明,该工程菌用LB培养基在37℃扩增至OD_(590)为0.5左右,加IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导5小时,此时His6-γTNFβ的表达量可占菌体总蛋白的45%.重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中.工程菌经反复超声破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再经含2mol/L脲的缓冲液洗涤可得到相对纯净的IBs.然后用7mol/L脲变性溶解IBs,离心取上清,进行Ni^(2+)-Sepharose 6B柱一步法亲和层析,可得到电泳纯度为95%的His6-γTNFβ,经稀释复性和用凝血酶切去His6-tag的产物,其细胞毒活性为(1.2～2.0)×10~7U/mgp,抗病毒活性为(6.0～6.6)×10~6U/map.

儿童哮喘病人的TNFβ基因遗传多态性

目的探讨人类TNFβ基因型在广州地区儿童支气管哮喘患者中的分布.方法采用PCR—RFLP技术检测TNFβ的等位基因在32例儿童哮喘患者和100例健康者间的分布.结果支气管哮喘病人TNFβ基因频率为TNFβ1 *0.4688,TNFβ2*0.5312.结论广州地区儿童支气管哮喘病人与TNFβ基因基因无明显相关.

哮喘病人的HLA-DRB、LMP、TNFβ基因遗传多态性

目的 探讨人类HLA -DRB、LMP、TNFβ基因型在广州地区支气管哮喘患者中的分布 .方法 采用序列特异性引物聚合酶链反应 (PCR -SSP)和PCR -RFLP技术检测HLA -DRB和LMP、TNFβ的等位基因在 5 2例哮喘患者和10 3例健康者间的分布 .结果 哮喘病人HLA -DRB频率 :DR10 .0 0 96、DR2 0 .192、DR30 .0 5 76、DR4 0 .0 86 5、DR110 .0 2 88、DR130 .0 0 96、DR70 .0 4 81、DR80 .0 76 9、DR90 .115、DR10 0 .0 0 96、DR空 0 .0 5 76 .哮喘病人TNFβ基因频率为TNFβ1 0 .4 32 6 ,TNFβ2 0 .5 6 73,支气管哮喘病人LMP基因频率为 :LMP2 A 0 .345 5、LMP2 B 0 .6 5 4 5、LMP7 A0 .5 185、LMP7 B 0 .4 815 .结论 广州地区哮喘病人与HLA -DRB、LMP。

子宫内膜异位症与肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性的关系

目的:探讨肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性与子宫内膜异位症的关系。方法:运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)技术检测子宫内膜异位症100例及正常100人肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性。结果:TNFβG252A基因型频率和等位基因频率在两组之间分别为23.0和25.0,58.0和57.0,19.0和18.0,52.5和53.5,47.5和46.5,差异无显著性(P>0.05)。结论:肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性与子宫内膜异位症无差。

信号转导抑制剂对TNFβ诱导L929细胞凋亡的研究

本文采用 FDA- PI荧光染色 ,DNA电泳和流式细胞仪等实验手段研究了本实验室自行重组并纯化的人 TNFβ对 L92 9细胞的细胞毒效应 ,结果表明 TNFβ主要是诱导 L92 9细胞以凋亡的形式死亡 .实验还采用 8种信号转导抑制剂 ,观察它们对 TNFβ杀伤 L92 9细胞的影响 ,以探讨细胞凋亡的信号转导途径 .初步研究表明 :磷脂酶 A2 ,Ca2 + 通道、丝氨酸蛋白酶的抑制剂能抑制 TNFβ对 L92 9细胞的杀伤 ,而且抑制剂的持续存在能更有效地发挥这一抑制作用 ;相反地 ,蛋白激酶 C和酪氨酸蛋白激酶的抑制剂可促进凋亡 ;而环加氧酶、磷脂酰肌醇 -

慢性乙型肝炎病人的TNFβ基因遗传多态性

目的探讨人类TNFβ基因型在慢性乙型肝炎患者中的分布。方法采用PCRRFLP技术检测TNFβ的等位基因在56例慢性乙型肝炎患者和100例健康者间的分布。结果慢性乙型肝炎病人TNFβ基因频率为TNFβ10.4911,TNFβ20.5089。结论慢性乙型肝炎病人与TNFβ基因无明显相关。

重组人肿瘤坏死因子β(HuTNFβ)的纯化及抗肿瘤效应的初步研究

本文利用能表达HuTNFβ的工程菌株(P20KLT)按常规培养及扩增．即采用LB培养液(内含Amp100．μg／ml Tet 5μg／ml)；1：40扩增．当A550达0．1时，加入IAA(20μg／ml)，当A550为1．0时，中止培养，离心(5000rpm，4℃)收集菌体。在菌体中按1：5加入缓冲液，冰浴中超声破碎，13，000rpm高速离心20分钟，

OVX大鼠正畸牙齿移动牙周组织TNFβ的表达

目的通过免疫组织化学方法，观察大鼠卵巢切除术（ＯＶＸ）后正畸牙周组织内ＴＮＦβ的表达，了解雌激素缺乏时正畸牙周组织的改建情况。方法将ＯＶＸ及对照组ＳＤ大鼠按术后的天数随机分为０、７、２１、４２ｄ组，分别施以相同的矫治装置，加力２周，力值４０ｇ，牵引大鼠第１磨牙向近中移动。实验结束后处死动物，取上颌正畸牙及其牙周组织作免疫组化染色。结果ＯＶＸ组大鼠正畸牙周组织内ＴＮＦβ呈强阳性表达，而对照组大鼠的相同部位ＴＮＦβ则呈阴性表达，主要阳性表达细胞为牙周成纤维细胞、破骨细胞；随着ＯＶＸ术后时间的延长，实验组大鼠牙周组织内ＴＮＦβ的含量逐渐增加，两组切片染色的灰度值差异有非常显著意义（Ｐ＜００１）。结论雌激素缺乏时正畸牙周组织改建有其特殊性，ＴＮＦβ在ＯＶＸ大鼠正畸牙周组织的改建中有重要作用，其机制尚需进一步研究。

γTNFβ体外杀伤肿瘤细胞的研究

用ＭＰＧ吸附层析法所制备的ＨｕＩＦＮ－γ／ＨｕＴＮＦβ重组双功能杂交蛋白（简称γＴＮＦβ）［１］去处理人宫颈癌细胞株ＭＥ１８０、胃癌细胞株７９０１和肺癌细胞株Ｇ６，结果表明此杂交蛋白对这三个细胞株都有明显的杀伤作用，其杀伤率显著高于同剂量的ＩＦＮ－γ或ＴＮＦ－β；用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法观察γＴＮＦβ在不同时间、不同剂量条件下对Ｇ６的增殖抑制，可得到同样的结论。用γＴＮＦβ与丝裂霉素Ｃ（Ｍｉｔｏ－Ｃ）一起处理胃癌７９０１细胞，结果表明在Ｍｉｔｏ－Ｃ１．０μｇ／ｍＬ浓度以下、γＴＮＦβ５０ｕ／ｍＬ浓度以下，两者具有良好的抑病协同效应。用γＴＮＦβ处理胃癌、肺癌细胞以及ｙγＴＮＦβ与化学细胞毒性药物协同抑癌尚未见有报道。本文的结果为深入研究γＴＮＦβ可能具有更有效的抗癌效应提供了实验依据。

人IFNγ／TNFβ杂交蛋白的初步纯化及其抗癌效应研究

采用国产的微孔玻璃珠吸附层析法分离纯化人干扰素γ／肿瘤坏死因子β重组杂交蛋白，它具有抗病毒和抗肿瘤的双重功能活性，其抗病毒活性为１．７×１０￣６ｕ／ｍｇ蛋白，细胞毒活性为１．４×１０￣６ｕ／ｍｇ蛋白。该杂交蛋白在体外对人宫颈癌细胞株（ＭＥ１８０），人胃癌细胞株（７９０１）和人肺癌细胞株（Ｇ６）均有明显的杀伤作用，并都显著地高于单一的ＩＦＮγ或ＴＮＦβ对这些肿瘤细胞的杀伤。本文还对γＴＮＦβ的抑瘤机理进行了初步探讨。

人γTNFβ对K562细胞株的杀伤效应及其电镜观察

本文用本实验室新分离的人γ干扰素／β肿瘤坏死因子(γTNFβ)杂合蛋白，对人髓性白血病细胞株K562(该细胞株对人TFNγ，TNFα和TNFβ均有一定抗性)进行了细胞毒效应的研究。实验用甲基纤维素半固体培养系统集落形成法(培养5天）和^3H-TdR掺入法进行，并以人IFNγ、TNFβ以及丝裂霉素C等单因子或双因子为对照比较研究。

芪黄疽愈方对ASO大鼠血液流变学和血脂指标及miR-133a、TNF-α表达的影响

目的探讨芪黄疽愈方改善肢体动脉硬化闭塞症(ASO)大鼠血液流变学和血脂指标及miR-133a、TNF-α表达的影响。方法雄性SD大鼠96只饲养1 w,随机选择18只作为空白组,剩余78只采用高脂饮食喂饲联合隐动脉内膜损伤的方法建立大鼠ASO模型,造模成功后随机分为模型组18只,西药组、芪黄疽愈方(中药高、中、低浓度组)各15只,分别给予生理盐水(1 ml/100 g大鼠)、西洛他唑片灌胃治疗(18 mg/kg,1次/d)、芪黄疽愈方相应浓度中药灌胃(1.0、0.5、0.1 ml/100 g体质量),观察一般情况并检测血脂、血流变、miR-133a、炎症细胞因子指标,并进行病理分析。结果空白组毛色光泽,饮食、饮水量正常;与中药组比较,模型组精神萎靡,饮食、饮水量相对减少。中药组随着用药剂量的增加,大鼠恢复正常越显著。空白组内皮细胞层完整,平滑肌层以平滑肌细胞和弹力纤维为主;模型组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,空泡细胞、脂质沉积。中药各浓度组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,空泡细胞、脂质沉积随着中药浓度增加而减少。西药组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,有少量空泡细胞、脂质沉积较少。治疗后,与空白组比较,模型组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、红细胞聚集指数、低切指数、高切指数显著升高,HDL显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,高浓度组血清TC、TG、红细胞聚集指数、低切指数、高切指数显著下降(P<0.05,P<0.01)。治疗后模型组TNF-α含量、miR-133a、TNF-αmRNA及蛋白表达水平明显高于空白组(P<0.05,P<0.01),中药高浓度组以上指标显著低于模型组(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,miR-133a与血脂指标(TC、TG、LDL-C),血流变学指标(红细胞聚集指数、低切指数、高切指数及动脉脂肪沉积量)呈正相关(r=0.633、0.732、0.573、0.749、0.764、0.832、0.583;P=0.016、0.002、0.025、0.011、0.003、0.001、0.020)。结论芪黄疽愈方在大鼠ASO模型中具有调节脂质代谢与降低血液黏稠度的作用,从而抑制炎症细胞因子TNF-α表达,也能抑制miR-133a mRNA及蛋白表达,从而起到保护动脉内皮、干预ASO发展进程的作用。

槲皮素联合山柰酚抑制TNF信号通路保护大鼠背根神经节细胞免受高糖损伤

目的 探究槲皮素(Quercetin, Que)联合山柰酚(Kaempferol, Kae)对高糖(high glucose, HG)引起大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞氧化损伤及凋亡的保护作用。方法 通过体外培养DRG细胞,CCK-8检测细胞活力,确定糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)体外模型建设条件、Que、Kae和二者组合的最佳给药浓度。DRG细胞分为5组(Con、HG、HG+Que、HG+Kae、HG+Que+Kae),ROS Assay Kit试剂盒和细胞凋亡荧光Hoechst 33342/PI双染试剂盒检测单药或组合药对HG诱导细胞产生ROS的影响和细胞过量凋亡的抑制作用;蛋白印迹法检测细胞死亡受体通路关键蛋白TNFR1、FADD、Caspase-8和Caspase-3的表达水平。结果 HG浓度达到85μM,作用时间24 h,细胞活力降至62%左右,低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,20μM的Que、5μM的Kae和10μM的Que加5μM的Kae对HG环境中DRG细胞保护性最好,细胞活力最高,差异均有统计学意义(P<0.05);单药或组合药均能降低细胞内ROS水平和抑制DRG细胞过量凋亡,具有抗氧化和抗凋亡作用,组合药优于单药;单药组或组合药组TNFR1、FADD、Caspase-8和Caspase-3的表达水平均低于HG组,其中组合组蛋白水平表达最低,差异有统计学意义(P<0.05),虽然HG+Que组有降低趋势,但是无统计学意义(P>0.05)。结论 Que联合Kae通过抗氧化和抑制细胞死亡受体通路,降低DRG细胞凋亡量,延缓DPN的进展。

D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α水平在COPD合并肺心病中的表达及诊断价值

目的分析D-二聚体、B型利钠肽原(NT-proBNP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平在COPD合并肺心病患者中的表达及诊断价值。方法选取COPD患者80例,其中42例合并肺心病者为COPD合并肺心病(合并)组,38例未合并肺心病者为单纯COPD组,选择30例健康志愿者为对照组,按照纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级标准将患者分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,对比各组D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α表达水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线预测D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α水平联合对COPD合并肺心病患者的预测价值。结果合并组D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α水平均高于对照组、单纯COPD组,且单纯COPD组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅳ级组D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α水平均高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级;Ⅲ级组均高于Ⅰ、Ⅱ级;Ⅱ级组均高于Ⅰ级,差异有统计学意义(P<0.05);经Pearson相关性分析,D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α之间呈正相关;D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α联合预测的曲线下面积(AUC)显著高于单独预测(P<0.05)。结论COPD合并肺心病患者应用D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α检测的临床价值明显,有利于评估患者心功能和肺动脉高压的严重程度,随着心功能恶化和肺动脉高压程度的加重,D-二聚体、NT-proBNP、TNF-α水平均升高。且三者检测方便,对COPD合并肺心病的诊断和病情评估及指导治疗、判断预后都有帮助。

VEGF/Akt信号通路在骨折大鼠愈合中作用机制及对炎症因子IL-6、TNF-α的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在骨折大鼠愈合中的作用机制及对炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法 选取健康清洁级SD雄性大鼠30只,按随机原则分为假手术组、模型组与对照组,每组10只。其中假手术组行假手术,模型组与对照组建立大鼠股骨骨折模型,对照组通过尾静脉注射经慢病毒转染高表达VEGF的骨髓间充质干细胞处理。4 w后通过四点断裂实验分析愈合后股骨的力学参数,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中成骨标记物骨源性碱性磷酸酶(BALP)、IL-6与TNF-α水平,通过苏木素-伊红(HE)染色观察股骨标本病理学变化,通过RT-聚合酶链反应(PCR)检测VEGF与p-Akt水平,通过Western印迹检测骨痂组织中p-Akt、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6、TNF-α蛋白水平。结果 对照组骨折部位承受的最大力及韧性均显著高于模型组(P<0.05)。对照组外周血中BALP水平显著高于模型组,IL-6与TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05)。与模型组相比,对照组骨折部位能观察到广泛的新骨生成,且骨组织中VEGF、p-Akt mRNA水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,对照组骨痂组织中eNOS与p-Akt蛋白表达显著上调,IL-6与TNF-α蛋白表达显著下调(P<0.05)。结论 激活VEGF/Akt信号通路能促进骨折大鼠的愈合,且能够抑制炎症反应。

壮医药线点灸治疗老年带状疱疹后遗神经痛效果及对血清TNF-α、IL-6水平的影响

目的 比较壮医药线点灸疗法与火针治疗老年带状疱疹后遗神经痛(PHN)的临床疗效,并观察其对患者细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平的影响。方法 将80例老年带状疱疹后遗神经痛患者随机分为观察组(40例)和对照组(40例)。观察组给予壮医药线点灸治疗,对照组给予火针治疗,两组均隔日治疗1次,3次/w, 2 w为1个疗程,共治疗3个疗程,疗程结束后观察疗效。观察比较两组视觉模拟评分(VAS)、临床疗效及细胞因子TNF-α、IL-6的表达水平。结果 观察组治疗第1次开始、对照组治疗第3次开始至治疗疗程结束,VAS均较治疗前显著降低(均P<0.05);两组间相比,从第1次治疗开始到第12次治疗的VAS差异均有统计学意义(P<0.05),且观察组缓解疼痛的起效时间显著早于对照组(P<0.01);两组血清因子TNF-α、IL-6含量均显著低于治疗前(均P<0.05)。结论 壮医药线点灸可以改善患者PHN的疼痛,止痛起效时间早,能较快缓解患者的疼痛,有效降低细胞因子TNF-α、IL-6的表达水平,减少了对神经系统的损伤,达到治疗PHN的目的。

丁酸对TNFα所致肠上皮屏障损伤的保护作用

目的探讨丁酸对TNFα所致肠上皮屏障损伤的保护作用。方法用CCK-8细胞活力检测探索TNFα对Caco2发挥损伤作用的最佳浓度和时间,并以此为基础探索在TNFα发挥损伤作用最佳作用时间附近丁酸对Caco2细胞的保护情况,随后探索TNFα和丁酸共同作用于Caco2细胞时的最佳时间和浓度,并检测Caco2细胞单层上皮屏障的FITC-dextran渗透率,紧密连接ZO-1和Occludin的mRNA表达情况及免疫荧光观察TNFα和丁酸共同作用后细胞的生长情况及ZO-1和Occludin在Caco2中的表达和分布。结果100 ng/mL的TNFα刺激48 h能明显降低Caco2的细胞存活率(P<0.0001);丁酸作用于Caco2细胞48 h,0.2 mM/L的丁酸能明显提高Caco2的细胞存活率(P<0.0001)。当TNFα和丁酸共同作用时,与TNFα干预组相比,丁酸可以明显降低TNFα所致的肠上皮单层屏障的FITC-dextran渗透率(P<0.0001),提高ZO-1(P<0.01)和Occludin(P<0.01)的表达及稳定其在Caco2细胞中的分布。结论丁酸可以减轻TNFα所致的肠上皮屏障损伤,为进一步明确丁酸在溃疡性结肠炎治疗中作用机制提供实验基础。

C1q/TNF相关蛋白3、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9对绝经后女性骨密度的影响

目的探究C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)、基质金属蛋白酶(MMP)-3及MMP-9对绝经后女性骨密度的影响。方法回顾性分析2019年6月至2022年6月江苏省南通市第三人民医院进行体检的92名自然绝经女性的临床资料。根据骨密度T评分将其分为健康组及骨质疏松组,骨质疏松定义为骨密度T评分≤-2.5 SD。比较两组CTRP3、MMP-3及MMP-9水平;CTRP3、MMP-3及MMP-9与骨密度的相关性采用Pearson相关性分析;受试者操作特征曲线评估CTRP3、MMP-3、MMP-9对骨质疏松的预测价值。结果骨质疏松组腰椎、股骨颈骨密度及骨矿含量水平均低于健康组(P<0.05)。骨质疏松组CTRP3水平低于健康组,MMP-3、MMP-9水平高于健康组(P<0.05)。CTRP3与腰椎、股骨颈骨密度呈正相关(r=0.451、0.483,P<0.05);MMP-3与腰椎、股骨颈骨密度呈负相关(r=-0.476、-0.439,P<0.05);MMP-9与腰椎、股骨颈骨密度呈负相关(r=-0.508、-0.449,P<0.05)。CTRP3、MMP-3及MMP-9联合预测的曲线下面积高于各指标单独预测。结论CTRP3、MMP-3及MMP-9水平与绝经后女性骨密度存在相关性,能够影响骨密度水平,且CTRP3、MMP-3、MMP-9联合诊断对于骨质疏松有一定的参考价值。