人可溶性TNF受体(sTNFRI)在大肠杆菌中的表达及其活性鉴定

目的 :构建人可溶性TNF受体I(sTNFRI)基因表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :用RT PCR扩增编码人TNFRI胞外段基因片段 ,将其插入到表达载体pET 2 8a ,并转入大肠杆菌进行表达。结果 :在IPTG诱导下 ,转入外源基因的大肠杆菌BL 2 1可高效表达sTNFRI蛋白 ,SDS PAGE显示在 2 7kD处有一特异表达条带 ,其表达量占菌体蛋白总量的 31%。纯化的sTNFRI可有效封闭TNF对L92 9细胞的胞毒效应 ;间接免疫荧光显示它可特异性抑制TNF与靶细胞TNFR的结合。结论 :通过基因工程技术获得了人sTNFRI重组蛋白。

肝癌患者血清可溶性TNF受体、IL—6水平的观察

TNF、IL—6在机体免疫中具有重要的生物学作用。机体的免疫功能与肝癌患者的病情发展密切相关。本文检测了32例肝癌患者,45例健康查体者发现两组血中可溶性TNF受体(STNFR)、IL—6水平明显高于对照组,显示肝癌组细胞免疫功能存在着障碍。

TNF受体(P55)胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用 ,在原核表达系统中表达了TNFR(P5 5 )的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR(P5 5 )胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体 pET 32a ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中高效表达了TrxA TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在 ,经过变性和复性 ,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化 ,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L92 9细胞体外实验均表明 :该蛋白具有TNFR(P5 5 )特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的生物学活性。

NB-UVB治疗寻常性银屑病量效关系及对血清TNF-α1受体和VEGF的影响

目的探讨窄谱中波紫外线(NB-UVB)治疗寻常性银屑病的量效关系及对患者血清TNF-α1受体和VEGF含量的影响。方法将69例寻常性银屑病患者随机分为A组(70%MED起始量+20%增量组)、B组(0.4J/cm2传统起始量+固定增量组)和C组(非照射组)三组,每组各23例,A,B组均为隔日NB-UVB照射1次,共治疗8周,同时选取12例志愿者作为健康对照组。采用酶联免疫吸附技术检测上述各组患者治疗前、治疗4周、8周后TNF-α1受体及VEGF含量变化情况;同时对各组患者进行PASI评分。结果 A,B,C三组患者经治疗4周后有效率分别为78.26%,26.09%,8.70%;8周后有效率为95.65%,69.57%,13.05%,A组疗效均明显优于B组和C组(P<0.01)。A,B两组治疗4,8周后VEGF水平均较治疗前显著降低(P<0.05),与B组比较,A组下降幅度更为明显(P<0.01)。A组的TNF-α1受体水平于治疗4,8周后均较治疗前明显降低(P<0.05);而B组直至治疗8周后才开始降低,与A组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论根据每个患者MED值确定NB-UVB的起始剂量后采用渐进性增量法治疗寻常性银屑病,其累积剂量上升快、总量高、可以更快控制病情,降低PASI评分;其可能是通过降低VEGF和可溶性TNF-α1受体水平,甚至达到正常人水平来实现的。

人可溶性sTNFR1及胞膜外区Ig融合基因重组腺病毒的真核表达及功能活性鉴定

目的构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用。方法将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用。结果成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功。表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P<0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P<0.05)。sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P<0.05)。结论携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关。sTNFR1及IgG-Fc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础。

sTNFR-IgGFc融合基因在内皮细胞中的表达及其对小鼠关节炎模型的基因治疗研究

可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子的活性,因此已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。本研究将sTNFR与IgGFc片段的融合蛋白基因克隆到真核表达载体pStar上,转染到人的内皮细胞中,获得了表达。表达的sTNFR-IgGFc能够拮抗TNFα对L929细胞的细胞毒活性。将该质粒DNA与脂质体混合,经尾静脉注射到Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠体内后,应用RT-PCR在鼠的肝脏检测到了sTNFR-IgGFc的表达,并显著地改善了治疗组小鼠关节炎症状和病理反应。这表明抗TNF基因治疗有可能作为治疗类风湿性关节炎的新的途径。

可溶性TNF受体及膜TNF受体检测方法的初步应用

本文采用竞争结合法测定了血清中可溶性ＴＮＦ受体（ＳＴＮＦＲ）。４９例ＳＬＥ病人血清中ｓＴＮＦＲ水平明显高于正常人。用放射受体分析法测定６例正常对照及４例肾脏肿瘤患者远离肿瘤的肾实质细胞膜表面的ＴＮＦ受体数目（Ｂｍａｘ）及亲和力（ＫＤ值）。结果Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图为曲线，人肾实质组织细胞膜表面存在高、低两种亲和力ＴＮＦ受体。

创伤使可溶性肿瘤坏死因子受体持续升高

肿瘤坏死因子(TNF)主要参与宿主对脓毒症、创伤和多器官衰竭的反应,近期已自人体生物液体中提纯55和75kDa的TNF可溶性受体(sTNF-R),后者可灭活TNF或作为缓慢释放TNF的贮存器。有作者认为sTNF-R可结合血清中TNF和防止其与靶细胞起反应,从而调控TNF的全身作用。作者研究100例创伤病人中sTNF-R升高的程度、时间及其与创伤严重度和终局的关系。全组100例,男74例,女26例,平均29.4岁(10～72岁),损伤严重度评分(ISS)平均16.8分(0～75分)。在创伤后1小时开始抽血测sTNF-R浓度,持续15天,用免疫酶联吸附法(多克隆抗体)进行分析。

肿瘤坏死因子研究进展

TNF(Tumour Necrosis Factor)作为细胞因子网络中的一员,据其所处局部微环境不同可表现出完全不同的作用。TNF在炎症及感染性疾病中起着重要作用,过量的TNF以及失去正常调控的TNF也参与某些疾病的发展。TNF在癌症的治疗和宿主抗肿瘤的免疫中具有一定作用。在实验动物模型中,重组的TNF能诱导肿瘤出血坏死和特异的肿瘤免疫反应。尽管历史资料和临床前期试验都表明TNF有抗肿瘤作用,但用TNF对癌症病人进行全身治疗时会产生严重的毒副作用,局部治疗可以取得一定疗效。但目前发现许多动物实验中,TNF对恶性疾病的发展起着一定作用,并且有证据证明TNF在人卵巢癌中起着自分泌和旁分泌作用。

肿瘤坏死因子α对小鼠胰岛内皮细胞表达胰岛素样生长因子结合蛋白7的影响

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对小鼠胰岛内皮(MS1)细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的mRNA和蛋白水平的影响,并探讨其机制。方法采用可溶性TNF受体Ⅰ(sTNFRⅠ)(50ng/ml)和不同浓度TNF-α(0、10、50、100、200、500ng/ml)作用MS1细胞,再收集TNF-α(100ng/ml)作用MS1细胞12h后的培养液,直接或加入sTNFRⅠ(50ng/ml)后培养新鲜的MS1细胞,采用RTPCR和Western blot检测各组MS1细胞中IGFBP7的mRNA和蛋白水平。结果与0ng/ml TNF-α组相比,100、200、500ng/ml TNF-α均可使MS1细胞中IGFBP7mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),其中500ng/ml TNF-α组最高(P<0.05);TNF-α(100ng/ml)作用MS1细胞12h后的培养液可明显提高IGFBP7的mRNA和蛋白水平(P<0.05),但该效应可被sTNFRⅠ(50ng/ml)完全抑制(P<0.05)。结论TNF-α可能是在转录水平促进MS1细胞IGFBP7表达的。