TNF-α单克隆抗体对小鼠变应性鼻炎的治疗作用及机制研究

目的探讨TNF-α抗体干预对小鼠变应性鼻炎(AR)的治疗作用及潜在分子机制。方法 18只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、AR模型组和TNF-α抗体干预组;采用卵清蛋白诱导致敏建立AR模型,于鼻腔刺激前滴加TNF-α单克隆抗体进行治疗;对各组小鼠进行行为学评分,H-E染色观察鼻黏膜组织病理学变化,TUNEL法检测细胞凋亡,ELISA检测鼻黏膜液中TNF-α、IL-1β、Ig E表达水平,Western blotting检测NF-κB p65、IκB及凋亡相关蛋白表达变化。结果 TNF-α抗体干预组变应性鼻炎症状减轻,炎症反应程度降低,鼻黏膜液中TNF-α、IL-1β、Ig E含量及鼻黏膜组织中NF-κB p65、cleaved caspase-3、Bax表达水平较AR模型组显著降低,I-κB及Bcl-2表达增加。结论 TNF-α单克隆抗体干预对小鼠变应性鼻炎具有一定的治疗作用,可能通过抑制NF-κB信号通路激活、调节Th1/Th2平衡、降低炎性因子水平、抑制细胞凋亡发挥作用。

TNF-α单克隆抗体对糖尿病周围神经病变的作用

目的探讨TNF-α单克隆抗体对糖尿病周围神经病变的治疗作用及其潜在机制。方法制备大鼠糖尿病周围神经病变大鼠模型,以TNF-α单抗处理模型大鼠,观察其对大鼠摆尾阈值、神经传导速度及氧化应激水平的影响。高糖条件培养RSC96细胞及原代DRG神经元细胞,观察TNF-α单抗处理对模型细胞氧化应激及凋亡水平的影响,检测TNF-α单抗对模型细胞中Nrf2信号通路的影响。结果 TNF-α单抗处理能明显改善模型大鼠神经病变症状,降低模型大鼠血清中丙二醛(MDA)含量,增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,并能降低RSC96细胞中ROS水平,改善氧化应激状况,抑制RSC96细胞与DRG神经元细胞凋亡水平(P <0. 05);同时还能增高RSC96细胞中Nrf2活化水平(P <0. 05)。结论 TNF-α单抗处理可促进神经细胞中Nrf2信号通路活化水平,进而改善氧化应激状况,抑制Schwann细胞与DRG神经元凋亡的发生,缓解糖尿病周围神经病变症状。

hTNF-α单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列及分子结构分析

从两株具有高亲和力及中和活性的抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基础。

抗TNF-α单克隆抗体对VMC小鼠影响的实验研究

目的:了解肿瘤坏死因子α(TNFα)在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用及抗TNFα单克隆抗体对心肌损伤的保护效应。方法:BalB/c小鼠随机分为正常对照组、病毒感染组和病毒感染加抗体治疗组,测定感染后7d和14d心肌组织TNFα的表达、病理变化、超微结构改变和小鼠生存率。结果:①治疗组TNFα表达较感染组低(P<0.05);②治疗组心肌病理变化和超微结构改变减轻,生存率提高;③感染组TNFα表达与心肌病变积分呈正相关(P<0.05)。结论:TNFα在病毒性心肌炎发病中发挥重要作用,抗TNFα单克隆抗体对受损心肌有保护作用。

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。

鼠抗hTNF-α单克隆抗体重链基因片段的克隆和cDNA序列测定

采用反转录ＰＣＲ方法，以一对锚ＰＣＲ引物和一对针对鼠ＩｇＶＨ区基因的引物，从分泌鼠抗ｈＴＮＦ－α单克隆抗体的Ｅ６杂交瘤细胞株中，分别扩增和克隆了自５′非翻译区至Ｃγ１近３′端的重链基因片段和重链可变区基因片段，并测定了其核苷酸序列。计算机分析表明，系重排的鼠Ｉｇ重链基因。

抗TNF-α单克隆抗体对大鼠肝肺综合征的治疗作用

目的：探讨抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（TNF-α（mAb）对肝肺综合征（HPS）大鼠的治疗作用。方法：采用胆总管结扎（CBDL）建立大鼠HPS模型，将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组。模型组：分别于结扎后1、2、3、4及5周麻醉动物（每个时间点6只大鼠）；干预组：于结扎后第2周，开始腹腔注射抗TNF-αmAb（0．1mg／kg·2d），干预后1、2、3及4周麻醉动物（每个时问点6只大鼠）；假手术组（6只大鼠）与5周模型组动物同批麻醉，留取各组动物的肝组织，分别行HE和Masson染色后，观察肝组织病理变化。抽取动脉血进行血气分析，计算肺泡、动脉氧分压差的变化。抽取各组动物的静脉血并分离血清，检测肝功能、内毒素、TNF-α、NO的水平。结果：干预组肝组织的炎症和纤维化明显减轻，动脉血气分析显示干预组动脉-肺泡氧分压差明显减少（P〈0．05），肝功能、内毒素、TNF-α及NO的水平较模型组明显好转（P〈0．05）。结论：抗TNF-αmAb对HPS大鼠具有治疗作用。

抗TNF-α单克隆抗体固定型免疫吸附剂的制备及其体外吸附效能

选用生物凝胶Ａ为载体，经交联、脱硫、筛选、溴化氰活化后，再共价结合抗重组人肿瘤坏死因子－ａ（ｒＨｕＴＮＦ－α）单克隆抗体，观察抗体偶联率及该免疫吸附剂体外吸附清除ＴＮＦ的效能。结果表明：①随着加入抗体量的增加，载体偶联的抗体量也逐渐增加，但当每毫升凝胶偶联抗体８．１２ｍｇ时，则基本达偶联量的峰值；②免疫吸附剂能高效清除循环中ＴＮＦ，而对正常血浆蛋白仅有少许非特异性吸附，且非特异性吸附较易洗脱。

TNF-α单克隆抗体治疗大鼠肝肺综合征的机制研究

目的:探讨肿瘤坏死因子-α抗体(TNF-α-McAb)抑制肝肺综合征大鼠TNF-α作用后肺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况,从而探讨TNF-α单克隆抗体对肝肺综合症治疗作用的机制。方法:采用胆总管结扎(CBDL)致大鼠肝肺综合征模型,将60只雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组和TNF-α-McAb干预组。采用HE染色观察肺组织病理变化,采用RT-PCR方法检测iNOS在肺组织中mRNA表达水平,免疫组织化学方法检测iNOS在肺组织中分布及含量的动态变化,采用Western blotting方法检测iNOS在肺组织中蛋白表达情况。结果:肺组织病理显示干预组病理改变炎症反应较模型组轻,TNF-α-McAb干预组大鼠肺组织中iNOS mRNA的表达、蛋白含量明显低于模型组。结论:肿瘤坏死因子-α单克隆抗体通过抑制iNOS的表达对肝肺综合征起到治疗作用。

抗TNF-α单克隆抗体治疗豚鼠分泌性中耳炎的实验研究

目的:观察抗TNF-α单克隆抗体对豚鼠分泌性中耳炎的治疗效果。方法:建立分泌性中耳炎的动物模型,随机分成空白对照组、造模组和TNF-αMcAb治疗组三组。比较光镜和电镜下中耳、咽鼓管粘膜的组织形态及处理组TNF-α蛋白含量变化。结果:TNF-αMcAb治疗组中耳、咽鼓管粘膜的组织形态接近于正常对照组,其TNF-α蛋白含量明显低于造模组(p<0.001)。结论:抗TNF-α单克隆抗体能拮抗TNF-α的炎症介导作用,对豚鼠分泌性中耳炎治疗有效。

抗TNF-α单克隆抗体对大鼠肝肾联合移植术后肝肾细胞凋亡的影响

目的探讨大鼠肝肾联合移植术后抗TNF-α单克隆抗体对移植肝肾组织细胞凋亡的影响。方法建立大鼠肝肾联合移植模型,80只大鼠按完全随机法均分为受体组与供体组,两两随机配对后均分为实验组和对照组。实验组:灌注4℃的生理盐水40ml(其中供肝经门静脉冷灌注30ml,供肾经肾动脉冷灌注10ml)+抗TNF-α单克隆抗体(0.1mg/kg体重);对照组:灌注等量4℃的生理盐水。于灌注后不同时点取静脉血检测肝肾功能,采用酶联免疫吸附(ELISA)法和原位DNA片断末端标记(TUNEL)法,检测移植肝肾组织中TNFα的含量及细胞凋亡情况。结果实验组血AST、ALT、Cr和BNN含量及移植肝肾组织中TNFα水平均明显低于对照组相应时相(P<0.05);实验组移植肝肾组织中细胞凋亡指数明显低于对照组相应时相(P<0.05);实验组移植肝肾组织病理改变不明显,组织结构基本正常。结论在肝肾联合移植过程中,应用抗TNFα单克隆抗体可减少移植肝肾组织内细胞凋亡,促进移植肝肾功能恢复。

抗人TNF-α单克隆抗体对银屑病患者血清TNF-α的中和研究

目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变化情况。结果:正常人与银屑病患者血清TNF-α的浓度分别为:(3.146±6.184)pg/ml及(62.723±38.379)pg/ml;其生物学活性分别为:(6.817±5.086)%及(57.498±9.125)%。抗体中和后患者血清TNF-α的浓度为:(0.503±1.178)pg/ml;中和后的生物学活性为:(25.378±14.863)%。结论:寻常型银屑病患者血清中TNF-α的浓度及生物学活性均高于正常对照,而抗人TNF-α单克隆抗体在体外可以很好地中和患者血清中TNFα的浓度及其生物学活性。

抗TNF-α单克隆抗体的研制现状及新策略

抗肿瘤坏死因子 α( TNF- α)单克隆抗体 ( Mc Ab)在临床治疗败血症休克、类风湿性关节炎等疾病中有广泛的应用前景 ,但传统的抗体制备技术在获得这样的自身组分的人源 Mc Ab时有明显的局限性。本文介绍了抗 TNF- α Mc Ab的研制现状 ,并分析了噬菌体抗体技术在制备人源抗TNF- α Mc

TNF-α单克隆抗体对急性胰腺炎胰腺组织中ICAM1的表达的影响

目的 探讨急性胰腺炎 (AP)胰腺组织中细胞间粘附分子 1(ICAM 1)的表达与炎症发生发展的关系 ,以及肿瘤坏死因子 α单克隆抗体 (TNF αMCAb)预处理后的影响。方法 采用免疫组化技术结合多媒体图像分析系统检测AP大鼠胰腺组织中ICAM 1的表达与炎症轻重程度的关系 ,以及应用TNF αMCAb对ICAM 1的表达的影响。结果 正常胰腺组织仅少量ICAM 1阳性表达 ,随着炎症程度的加重 ,ICAM 1表达逐渐升高 ,与炎症程度呈正相关。应用TNF αMCAb预处理后胰腺组织I CAM 1表达明显减弱 ,炎症程度明显减轻。结论 急性胰腺炎ICAM 1的表达在炎症的发生发展中起着重要的作用 ,TNF αMCAb通过抑制ICAM 1的表达 ,减轻了胰腺组织炎症反应 。

抗rhTNF-α单克隆抗体F(ab′)_2片段的制备

采用胃酶消化抗ｒｈＴＮＦ－αＭｃＡｂ制备了其Ｆ（ａｂ′）２片段。对胃酶消化的时间，酶／抗体的比例及片段回收率等条件做了比较。结果显示，胃酶在ｐＨ４．２于３７℃消化１８ｈ，可制备出完整的Ｆ（ａｂ′）２片段；非还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ发现，有９０％以上的ＩｇＧ被降解为Ｆ（ａｂ′）２片段；Ｓ－２００层析柱纯化Ｆ（ａｂ′）２片段的回收率达４５％；双抗体夹心竞争抑制ＥＬＩＳＡ法测定Ｆ（ａｂ′）２片段的竞争抑制效价为２．６×１０７。中和Ｌ９２９细胞毒活性试验的结果表明，１４８ｎｇ的Ｆ（ａｂ′）２片段可中和１个单位ｒｈＴＮＦ－α的细胞毒作用。

抗人TNF-α单克隆抗体抗原识别表位的初步研究

目的 :确定抗人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)单克隆抗体 (Z8)识别的抗原表位所在区域。方法 :分别构建缺失hTNF α不同部位的重组质粒 ,用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果 :Z8特异性识别含有hTNF αC端 92 15 7位氨基酸在内的融合蛋白 ,而不识别GST及其与hTNF αN端 1 91位氨基酸所形成的融合体。结论 :Z8抗体识别的抗原表位位于hTNF α 92 15 7区。

拮抗型抗hTNF-α单克隆抗体的筛选和活性鉴定

目的制备和筛选拮抗型人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体(McAb)并检测其活性,为临床靶向治疗提供理论依据。方法用经典免疫方法获得抗hTNF-αMcAb,经接种于小鼠腹腔后获得腹水,采用硫酸铵沉淀和蛋白G亲和层析法纯化得到纯度>95%的抗hTNF-αMcAb,采用ELISA方法测定效价、抗体亚型和亲和力,MTT法测定抗体阻断hTNF-α对L929细胞的细胞毒作用和筛选拮抗型抗hTNF-αMcAb,流式细胞仪法测定抗体阻断hTNF-α诱导L929细胞凋亡的作用。结果获得1株能稳定分泌抗hTNF-αMcAb的杂交瘤细胞株XB10,分泌的抗体亚型为IgG2b;该抗体能高亲和性与hTNF-α结合,特异性阻断hTNF-α对L929细胞的细胞毒作用和抑制细胞凋亡,并呈一定剂量依赖性。结论成功制备能稳定分泌拮抗型抗hTNF-α的McAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体对hTNF-α有特异性拮抗作用,为今后研制临床治疗型抗hTNF-α的基因工程抗体奠定了实验基础。

抗TNF-α单克隆抗体对噬菌体随机12肽库的筛选

目的试从噬菌体随机多肽库中筛选出能与肿瘤坏死因子 α(TNF α)特异性结合的短肽分子。方法采用抗TNF α单克隆抗体作为配基 ,免疫亲和筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13 外壳蛋白Ⅲ表达的随机 12肽文库 ,按“吸附 -洗脱 -扩增”的淘洗过程 ,经过 3轮免疫筛选后 ,随机挑取阳性噬菌体克隆用ELISA及斑点ELISA检测其特异性。结果经过 3轮免疫筛选 ,特异性结合的阳性噬菌体克隆富集增加近10 0倍 ,第 3轮筛选后随机挑选 7个阳性噬菌体克隆经ELISA和斑点ELISA检测 ,有 5个克隆能与抗TNF α特异性结合。结论噬菌体随机肽库技术可以应用于分析、鉴定抗TNF α的表位 ,继而为获得亚单位表位水平的诊断试剂和抗TNF

全人源化抗人TNF-α单克隆抗体毛细管区带电泳鉴别方法的建立及验证

目的建立及验证用于全人源化抗人TNF-α(Tumor necrosis factor-α)单克隆抗体(简称抗人TNF-α单抗)鉴别的毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis,CZE)方法。方法采用DB-1毛细管,以样品检测分离度、迁移时间、电流及峰形为判断标准,筛选CZE过程中的各种参数(缓冲液p H、ε-氨基乙酸浓度、乙酸钠浓度、羟丙基纤维素浓度、样品稀释剂、进样时间及运行电压等),建立CZE方法,并对方法的专属性、精密度、中间精密度进行验证。结果建立的CZE方法参数条件为:缓冲液p H为5.0,EACA浓度为300 mmol/L,乙酸钠浓度为20 mmol/L,HPMC质量分数为0.05%,用50 mmol/L Tris稀释样品,进样时间为15 s,运行电压为20 k V。样品制备重复性主峰迁移时间RSD为0.459%,中间精密度RSD为1.145%。结论 CZE方法分离度高、专属性强、重复性和精密度好、简单快速,可作为全人源化抗人TNF-α单抗的鉴别方法。