miR-526b-3p通过靶基因TNKS2调控肝癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制探讨

目的:探讨miR-526b-3p对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其潜在的作用机制。方法:运用qRT-PCR检测人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和正常肝细胞L02中miR-526b-3p和TNKS2的mRNA表达水平。建立miR-526b-3p过表达和TNKS2抑制表达的HepG2细胞株,采用MTT法检测细胞增殖活力,Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力,Western blot检测TNKS2蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因分析法验证miR-526b-3p可能的靶基因。结果:与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞HepG2、SMMC-7721及BEL-7402中miR-526b-3p的表达显著降低(P<0.05),TNKS2的表达显著升高(P<0.05)。过表达miR-526b-3p或抑制表达TNKS2均可抑制HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭(P<0.05)。TNKS2是miR-526b-3p的靶基因。过表达TNKS2可部分逆转过表达miR-526b-3p对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论:miR-526b-3p可通过下调TNKS2的表达,从而抑制肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

从调控TNKS2/APC蛋白探讨培土生金法对非小细胞肺癌转移干预的体外研究

[目的]基于培土生金理论探讨经方黄土汤含药血清通过调控端锚聚合酶2(tankyrase 2,TNKS2)/腺瘤样息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)蛋白抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)转移的作用机制。[方法]采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)筛选出人肺癌细胞株A549、PC9、H125、H647细胞中的TNKS2高表达细胞系H647以及低表达细胞系A549,再利用慢病毒构建A549 TNKS2过表达细胞系以及H647 TNKS2干扰细胞系。选取体质量为200g的雄性SD大鼠,以浓度为7.8g·mL-1的黄土汤水煎剂灌胃,1周后分离含药血清。通过细胞划痕实验检测经TNKS2基因表达变化、黄土汤含药血清干预以及黄土汤含药血清联合TNKS2基因表达变化干预后,H647和A549细胞迁移能力变化。将细胞分成黄土汤含药血清+H647siRNA干扰组、H647siRNA干扰组、黄土汤含药血清+A549过表达组及A549过表达组4组,以Western blot法检测TNKS2蛋白和APC蛋白表达变化。[结果]A549、H125、PC9以及H647细胞随着细胞恶性程度增加,qPCR结果显示其TNKS2基因表达量随之增加。H647细胞TNKS2基因表达明显高于A549、H125、PC9细胞系,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.01);A549和H125细胞TNKS2基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。划痕试验结果显示TNKS2基因高表达细胞系迁移能力较强,黄土汤含药血清能够抑制A549、H647细胞迁移能力(P<0.01,P<0.001),也能抑制经TNKS2基因作用后的A549、H647细胞迁移能力(P<0.05,P<0.001)。Western blot结果显示,黄土汤含药血清能抑制TNKS2基因过表达的A549细胞中TNKS2表达(P<0.05),调高经TNKS2基因干扰的H647细胞中APC表达(P<0.05)。[结论]培土生金法对恶性程度不同的NSCLC细胞转移均有抑制作用,可通过下调TNKS2表达或诱导抑癌蛋白APC表达,从而影响NSCLC的发生、发展、转移。

miR-1-3p靶向TNKS2抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR-1-3p靶向端锚聚合酶2(TNKS2)基因对宫颈癌Ca-Ski细胞增殖、迁移及侵袭的调控作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测正常宫颈鳞状细胞及不同宫颈癌细胞中miR-1-3p的表达情况,选取宫颈癌Ca-Ski细胞进行转染实验,利用脂质体转染法将miR-1-3p模拟物(miR-1-3p mimics)及模拟物对照(NC mimics)分别转染至Ca-Ski细胞,分别记为miR-1-3p mimics组和miR-NC组,将未经转染处理的Ca-Ski细胞记为Blank组(空白对照)。qRT-PCR检测各组Ca-Ski细胞中miR-1-3p的表达,噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,通过生物信息学软件分析和双荧光素酶报告基因实验验证miR-1-3p和TNKS2靶向关系,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中TNKS2蛋白表达。结果 miR-1-3p在宫颈癌细胞中的表达显著低于正常宫颈鳞状细胞(P<0.05)。转染miR-1-3p mimics 48 h后,Ca-Ski细胞中miR-1-3p的表达显著升高(P<0.05)。过表达miR-1-3p能够明显抑制Ca-Ski细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。生物信息学软件分析显示miR-1-3p和TNKS2 3’UTR存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验显示TNKS2是miR-1-3p的靶基因,Western blot检测结果显示miR-1-3p可抑制TNKS2的表达。结论 miR-1-3p可靶向TNKS2基因抑制宫颈癌Ca-Ski细胞增殖、迁移及侵袭。

端锚聚合酶2在结直肠癌组织中的表达水平

目的分析结直肠癌与其癌旁组织中端锚聚合酶2(TNKS2)的表达差异情况,探讨TNKS2在结肠癌中发生发展的作用。方法收集30例结直肠癌患者肿瘤组织及其癌旁组织,常规抽提组织中的总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测样本中TNKS2的表达情况。结果结直肠癌组织中TNKS2mRNA表达高于癌旁组织(P<0.05);与癌旁组织相比,肿瘤组织中TNKS2的表达量上升(P<0.05)。结论结直肠癌中TNKS2在分子水平和蛋白水平都高表达,猜测TNKS2表达上升使TRF1与端粒之间的表达失衡从而引发细胞永生化。

lncRNA TNK2‐AS1调控miR‐802表达对结直肠癌细胞增殖与迁移的影响

目的探讨长链非编码RNA TNK2反义RNA 1(lncRNA TNK2‐AS1,简称TNK2‐AS1)调控微小RNA‐802(miR‐802)表达对结直肠癌HT29细胞增殖、迁移、侵袭的作用与机制。方法qRT‐PCR检测TNK2‐AS1和miR‐802表达;双荧光素酶报告基因实验、RNA pull down和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证TNK2‐AS1和miR‐802的靶向关系;将细胞分为NC组、pcDNA‐NC组、pcDNA‐TNK2‐AS1组、si‐NC组、si‐TNK2‐AS1组、si‐TNK2‐AS1+inhibitor‐NC组、si‐TNK2‐AS1+miR‐802 inhibitor组;Western blot检测蛋白表达;MTT法和EdU法分别检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移与侵袭;检测裸鼠移植瘤的质量和体积及TNK2‐AS1和miR‐802表达。结果与癌旁组织比较,结直肠癌组织中TNK2‐AS1表达升高(分别为1.00±0.05、2.83±0.21,P<0.05),miR‐802表达下降(分别为1.00±0.06、0.44±0.03,P<0.05);与正常结肠上皮细胞NCM460中TNK2‐AS1、miR‐802表达(1.00±0.05)比较,结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116和HT‐29中TNK2‐AS1表达升高(分别为1.64±0.19、1.37±0.36、1.48±0.30、1.92±0.25,均P<0.05),miR‐802表达下降(分别为0.65±0.08、0.53±0.04、0.69±0.05、0.41±0.02,均P<0.05);TNK2‐AS1和miR‐802具有靶向关系;过表达TNK2‐AS1促进HT29细胞增殖、迁移侵袭,下调miR‐802表达(P<0.05);与si‐NC组比较,si‐TNK2‐AS1组HT29细胞TNK2‐AS1表达、增殖能力、CyclinD1表达、细胞迁移、侵袭数目及MMP‐2、MMP‐9表达明显下降,miR‐802表达明显上升(P<0.05);抑制miR‐802表达逆转了沉默TNK2‐AS1表达对HT29细胞增殖、迁移及对裸鼠移植瘤的抑制作用(P<0.05)。结论沉默TNK2‐AS1表达可能靶向上调miR‐802表达,抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及移植瘤生长。

利用端粒和端粒酶PCR芯片筛选易发/抗肺纤维化小鼠肺组织差异基因研究

目的通过建立易发/抗放射性肺纤维化(RIPF)小鼠模型,利用端粒和端粒酶实时荧光定量PCR(RT-qPCR)芯片筛选易发/抗RIPF小鼠照射前后肺组织差异基因并初步验证。方法采用20 Gy^(60)Coγ射线照射C57BL/6J和C3H/HeN小鼠胸部;通过HE、天狼星红染色,羟脯氨酸、转化生长因子β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)含量检测等,比较这两种小鼠RIPF进程的差异;采用端粒和端粒酶RT-qPCR芯片,分别比较照射前、照射后3个月两种小鼠肺组织端粒和端粒酶相关基因的表达差异,并采用RT-qPCR对差异基因进行初步验证。结果照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织纤维化性病变较C3H/HeN小鼠更为明显;C57BL/6J小鼠肺组织中羟脯氨酸含量显著高于照射前和C3H/HeN小鼠(P<0.05),且其肺泡壁Ⅰ型胶原沉积显著多于C3H/HeN小鼠;C57BL/6J小鼠肺组织促纤维化细胞因子TGF-β和CTGF含量明显高于C3H/HeN小鼠(P<0.05)。端粒和端粒酶RT-qPCR芯片筛选发现,两种对照组小鼠肺组织差异基因48个;照射后3个月两种小鼠肺组织差异基因32个;照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织与照射前相比有8个差异基因,C3H/HeN小鼠肺组织与照射前相比有4个差异基因。对差异基因端锚聚合酶2(Tnks2)基因进行验证,照射前及照射后3个月C3H/HeN小鼠肺组织中Tnks2的表达均高于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。结论^(60)Coγ射线照射前后易发/抗肺纤维化小鼠肺组织存在多个端粒及端粒酶相关差异基因。