高血压脑出血患者血清微小RNA-93、Toll样受体4表达及其与患者短期预后的相关性

目的探讨高血压脑出血患者血清微小RNA-93(miR-93)、Toll样受体4(TLR4)表达水平与短期预后的相关性。方法选取2019年12月至2020年12月榆林市第一医院接收的104例高血压脑出血患者为观察组,根据入院时格拉斯哥昏迷评分将患者分为轻度亚组、中度亚组、重度亚组,治疗4个月后根据格拉斯哥预后量表(GOS)评分将患者分为预后良好组69例和预后不良组35例;同期对照组选本院98例健康体检者。收集观察组及对照组性别、年龄、合并症等一般资料,检测血清miR-93、TLR4水平;分析高血压脑出血患者血清miR-93与TLR4水平相关性;分析影响高血压脑出血患者预后的因素。结果重度亚组血清TLR4水平高于中度亚组、轻度亚组和对照组,miR-93水平低于中度亚组、轻度亚组和对照组(F=712.900、105.700,P<0.01);中度亚组血清TLR4水平高于轻度亚组和对照组,miR-93水平低于轻度亚组和对照组(P<0.01);轻度亚组血清TLR4水平高于对照组,miR-93水平低于对照组(P<0.01)。轻度亚组、中度亚组和重度亚组高血压脑出血患者血清miR-93与TLR4水平均呈负相关(r=-0.530、-0.502、-0.447,P<0.05)。与预后良好组比较,预后不良组血清TLR4水平、出血量、合并高脂血症、合并感染、合并消化道出血、出血破入脑室患者比例较高,血清miR-93水平降低(t/χ^(2)=36.216、9.999、4.757、12.671、10.668、7.597、14.599,P<0.05)。TLR4是高血压脑出血患者预后不良的危险因素[OR(95%CI)=2.714(1.712~4.302),P<0.01],miR-93是高血压脑出血患者预后不良的保护因素[OR(95%CI)=0.879(0.839~0.921),P<0.01]。结论高血压脑出血患者血清miR-93水平较低、TLR4水平较高,且两者对患者病情评估及预后评估可能有一定价值。

颅脑损伤病儿血清血凝素样氧化低密度脂蛋白受体、Toll样受体4表达水平及临床意义研究

目的检测颅脑损伤病儿血清血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)、Toll样受体4(TLR4)表达水平,探讨二者与颅脑损伤病儿发病的关系。方法选取2020年1—12月在南京市儿童医院就诊的颅脑损伤病儿82例作为研究对象;另选取同时期保健科体检的90例健康儿童作为对照组。颅脑损伤病人出院后6个月,根据治疗结果格拉斯哥预后量表(GOS)评定,分为预后不良组33例和预后良好组49例。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测所有受试者病儿血清LOX-1、TLR4表达水平,经Pearson法分析颅脑损伤病儿血清LOX-1、TLR4的相关性,受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析LOX-1、TLR4水平对颅脑损伤病儿预后不良的预测价值;logistic回归分析影响颅脑损伤病儿预后不良的有关因素。结果与对照组[(3.13±0.97)μg/L、(0.52±0.11)μg/L]相比,颅脑损伤病儿血清LOX-1[(13.24±1.69)μg/L]、TLR4表达水平[(8.83±1.57)μg/L]升高(P<0.05);预后不良病儿(功能受限、活动受限)血清LOX-1[(16.31±2.30)μg/L]、TLR4水平[(11.19±2.05)μg/L]较预后良好病儿高[(11.17±1.28)μg/L、(7.19±1.25)μg/L](P<0.05);经Pearson法分析颅脑损伤病儿预后不良血清LOX-1、TLR4水平呈正相关(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,LOX-1、TLR4的曲线下面积(AUC)及其95%置信区间(CI)分别为0.76(0.65,0.88)、0.75(0.64,0.87),二者联合诊断颅脑损伤病儿预后不良的AUC为0.91(0.84,0.98),与LOX-1、TLR4单独检测比较,二者联合诊断颅脑损伤病儿预后不良的AUC更高(Z=2.18、2.35,P=0.029、0.019);多因素logistic回归分析结果表明血清LOX-1、TLR4是颅脑损伤预后结果发生的影响因素(P<0.05)。结论颅脑损伤病儿血清LOX-1、TLR4表达水平异常升高,监测血清LOX-1、TLR4水平可能有助于判断病人病情程度以及预后情况。

痛风性关节炎患者外周血白细胞中Toll样受体4表达与基因多态性研究

目的对痛风性关节炎患者外周血白细胞中Toll样受体4(TLR4)表达与基因多态性予以分析,为痛风性关节炎的早期诊断和治疗提供参考。方法选择2015年1月—2016年6月右江民族医学院附属医院确诊为痛风性关节炎患者及同期体检健康者为观察组和对照组,每组各80例。均行外周血白细胞中TLR4表达测定和基因型鉴定并进行比较和评价。结果观察组外周血白细胞中TLR4 mRNA、核因子-κBD65、血浆IL-1β及血尿酸水平均显著高于对照组(P<0.05);观察组GGb、GT及G等位基因b与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),观察组TT和T等位基因均显著高于对照组(P<0.05)。结论痛风性关节炎患者外周血白细胞中TLR4表达与TT和T等位基因均表现出较强的表达及较高的的比率,对临床诊断及治疗具有一定的指导价值。

内毒素对人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4表达的影响

目的:观察内毒素(LPS)刺激后人牙周膜细胞Toll样受体2和Toll样受体4的表达,探讨牙周膜细胞作为免疫活性细胞在牙周炎局部免疫反应中的作用。方法:组织块法原代培养人牙周膜细胞,经来源鉴定后,取生长良好的第4代细胞用LPS进行刺激,分别于刺激0、4、8、12、24 h,运用免疫细胞化学染色法检测TLR2和TLR4在牙周膜细胞中的表达;利用多功能真彩色细胞分析管理系统进行图像分析,对TLR2和TLR4进行免疫组化评分(IHS)。结果:无LPS刺激的对照组(刺激O h)TLR2和TLR4的表达均为弱阳性,加入LPS后,染色增强,且随着刺激时间的延长而增加(P<0.05),LPS刺激后各时间点TLP2和TLR4的IHS分值与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:内毒素的刺激可以使牙周膜细胞TLR2和TLR4表达增多,提示牙周膜细胞参与牙周局部免疫反应。

IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌

目的:了解在体外培养条件下免疫球蛋白G(IgG)刺激对小胶质细胞表达Toll样受体4(TLR4)和分泌细胞因子的作用。方法:用不同浓度的IgG(2mg/L、20mg/L、200mg/L)及脂多糖(LPS)(10mg/L)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞,24h后以免疫荧光染色观察TLR4的表达,ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)的含量。结果:IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞后,以剂量依赖的方式引起TLR4的表达和TNF-α的分泌,但未检测到IFN-γ含量的变化。作为阳性对照的LPS引起了小胶质细胞TLR4表达,并诱导了TNF-α及少量IFN-γ的分泌。结论:同种IgG刺激可使体外培养的小胶质细胞大量表达TLR4,可能通过MyD88依赖途径导致炎性细胞因子分泌。结果提示至少在中枢神经系统的固有免疫反应中,TLR4可能发挥识别病原体之外的蛋白分子,例如IgG的作用。

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞Toll样受体4表达的影响

目的研究黄芩苷对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞Toll样受体4和其下游信号分子抑制蛋白κB以及效应分子肿瘤坏死因子α表达的影响。方法分别用脂多糖(终浓度1 mg/L)或脂多糖+黄芩苷(终浓度10、50和100μmol/L)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,逆转录聚合酶链反应和Western Blot检测细胞Toll样受体4表达情况和抑制蛋白κB含量变化,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α的浓度。结果脂多糖刺激RAW264.7细胞可导致Toll样受体4表达增高,促进抑制蛋白κB降解,上调肿瘤坏死因子α表达;黄芩苷预处理能降低脂多糖诱导的Toll样受体4表达增高,降低抑制蛋白κB降解,下调肿瘤坏死因子α分泌。结论黄芩苷可通过抑制Toll样受体4表达和降低抑制蛋白κB降解,影响Toll样受体4/抑制蛋白κB-核因子κB炎症信号途径,阻碍炎症因子肿瘤坏死因子α的生成,发挥抗炎作用,这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一。

脂多糖诱导下慢性阻塞性肺疾病大鼠模型远端肺动脉平滑肌细胞中Toll样受体4表达情况研究

背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以不完全可逆的气流受限为特征的慢性支气管炎和肺气肿,也是导致肺动脉高压的主要原因之一,但其发生发展机制尚未完全清楚。目的探讨脂多糖(LPS)诱导下COPD大鼠模型远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中Toll样受体(TLR)4表达情况,以期为探讨TLR4信号通路在COPD炎性反应及免疫应答中的作用提供理论基础。方法 2015年12月—2016年3月,选取SPF级Wistar大鼠24只,雌雄对半,6~8周龄。适应性饲养大鼠1周后,将其随机分为模型组和正常组,各12只。模型组大鼠于实验第1、14天经气道注入1μg/ml的LPS 200μl,置于自制有机玻璃舱,烟熏1 h/d,共8周;正常组大鼠于实验第1、14天经气道注入等量0.9%氯化钠溶液,与模型组大鼠在同等条件下饲养8周。8周后,两组分别随机选取2只大鼠,开胸取肺组织,分别进行HE染色观察肺组织病理学改变和免疫组织化学染色观察肺动脉平滑肌层TLR4表达情况。从模型组剩余大鼠中随机选取6只,分离、培养远端PASMCs,选用第3~6代(对数生长期)细胞,光镜下(×100)观察PASMCs形态,采用免疫荧光法(荧光显微镜下,×200)观察其α-肌动蛋白表达情况,并随机分为对照组(不进行干预)、LPS 12 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用12 h)、LPS 24 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用24 h)、LPS 48 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用48 h)、LPS 72 h组(加入1μg/ml的LPS 10μl作用72 h),采用Western blotting法检测各组PASMCs中TLR4表达水平。结果肺组织病理学改变:模型组肺泡壁断裂,肺泡融合,肺大泡形成,肺动脉平滑肌层明显增厚,大量炎性细胞浸润,病理表现符合典型的COPD病理改变。肺动脉平滑肌层TLR4表达情况:模型组倒置相差显微镜下可见TLR4表达阳性,且肺动脉平滑肌层染成黄色较正常组颜色明显加深。PASMCs形态及其α-肌动蛋白表达情况:光镜下PASMCs呈梭形、不规则生长,随着培养时间的延长,层数增多,堆积形成"峰-谷"状;荧光显微镜下可见PASMCs胞质α-肌动蛋白表达阳性,胞质中有向细胞两极呈放射状分布的条丝状物,与细胞长轴平行,形态清晰。LPS 12 h组、LPS 24 h组、LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于对照组(P<0.05);LPS 24 h组、LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于LPS 12 h组(P<0.05);LPS 48 h组、LPS 72 h组PASMCs中TLR4表达水平均高于LPS 24 h组(P<0.05)。结论 LPS诱导下COPD大鼠模型远端PASMCs中TLR4表达水平升高,猜测LPS可能通过TLR4信号通路诱导PASMCs的合成分泌功能,从而加重炎性反应及肺血管重塑。

沉默Toll样受体4表达对肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期的影响

目的探讨Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)对肺腺癌A549细胞凋亡及细胞周期的影响。方法体外化学合成针对TLR4的小干扰RNA(TLR4-si RNA),通过脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞。采用Real-time PCR和流式细胞仪检测分析干扰后A549细胞中TLR4 m RNA及蛋白的表达情况。另外,采用流式细胞仪检测分析干扰72 h后细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果与对照组比较,转染TLR4-si RNA后,A549细胞中TLR4 m RNA及蛋白的表达显著下降(P<0.05),细胞的凋亡率明显增加[(1.73±0.32)%vs.(7.40±0.75)%(P<0.01)],细胞周期出现G0/G1期停滞[(48.21±1.15)%vs.(66.26±2.45)%(P<0.05)],同时S期细胞比例明显减少[(34.25±1.46)%vs.(22.63±3.39)%(P<0.05)]。结论 TLR4-si RNA能有效沉默A549细胞中TLR4的表达,在促进细胞凋亡的同时能够影响细胞周期分布从而抑制肿瘤细胞的生长,特异性干预TLR4基因的表达有望成为治疗肺癌的一种新手段。

接受择期PCI术的急性冠脉综合征患者外周血单核细胞Toll样受体4表达及强化阿托伐他汀治疗对其的影响

目的探讨接受择期经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术的急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)表达水平与ACS发生和冠脉病变严重程度的相关性,同时观察强化阿托伐他汀治疗对TLR4表达的影响。方法选取行择期PCI术的ACS患者75例,随机分为强化组和常规组,强化组入院后予以阿托伐他汀40 mg/d,PCI术后持续,4周后减量至20 mg/d;常规组入院后予以阿托伐他汀20 mg/d,PCI术后持续,4周后仍维持20 mg/d。采用流式细胞仪检测入院时和4周后患者外周血单核细胞TLR4表达水平的变化,采用Gensini评分反映冠脉病变严重程度。同时选择健康体检者20例作为正常对照组。结果 1与正常对照者相比,ACS患者外周血单核细胞TLR4表达明显升高,急性心肌梗死(AMI)患者明显高于不稳定性心绞痛(UP)患者,3支病变者明显高于1支、2支病变者,差异均有统计学意义(P<0.01);相关分析和多元逐步线性回归分析结果显示ACS类型、冠脉狭窄积分、冠脉病变支数与外周血单核细胞TLR4表达水平呈正相关性,对其影响最大(P<0.05)。2阿托伐他汀治疗4周后两组外周血单核细胞TLR4表达、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、甘油三脂(TG)明显降低,高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01);与常规组相比,强化组外周血单核细胞TLR4表达、TCH、LDL-C降低更显著,HDL-C升高更显著,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论外周血单核细胞TLR4表达增加与ACS发生和冠脉病变严重程度密切相关,强化阿托伐他汀治疗明显降低行择期PCI术的ACS患者外周血单核细胞TLR4表达。

加味凉膈散含药血清对脂多糖刺激小鼠血小板Toll样受体4表达及细胞因子释放的影响

目的观察加味凉膈散对小鼠血小板Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)表达及对血小板源细胞因子IL-8、β血小板球蛋白(β-TG)、可溶性CD40配体(sCD40L)释放量的影响。方法比较脂多糖(LPS)刺激TLR4单克隆抗体封闭和不封闭的血小板对细胞因子释放的影响。应用加味凉膈散低(0.94g/mL)、中(1.89g/mL)、高(2.84g/mL)剂量含药血清孵育LPS刺激的血小板,观察血小板TLR4表达及血小板源细胞因子释放量的变化。结果 LPS刺激后血小板TLR4阳性表达率明显降低(P<0.01),sCD40L和β-TG释放量显著升高(P<0.01);加入TLR4单克隆抗体后,sCD40L和β-TG释放量明显下降(P<0.05,P<0.01)。LPS刺激前后IL-8浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS组比较,加味凉膈散中、高剂量含药血清组血小板TLR4阳性表达率明显升高(P<0.01);血小板sCD40L和β-TG的释放量明显下降(P<0.01,P<0.05),且随剂量增加抑制作用增强。结论 LPS通过血小板TLR4诱导血小板活化并释放细胞因子sCD40L、β-TG,而血小板IL-8的释放不依赖于血小板TLR4-LPS途径;加味凉膈散能抑制LPS刺激的血小板释放sCD40L、β-TG,并以剂量依赖方式抑制LPS与血小板TLR4的结合,减少血小板细胞因子的释放。

乳铁蛋白下调脂多糖激发的人牙周膜细胞Toll样受体4表达的研究

目的观察乳铁蛋白(LF)对经脂多糖(LPS)刺激的人牙周膜细胞(hPDLCs)表达Toll样受体4(TLR4)的影响。方法采用组织块酶消化法培养hPDLCs,鉴定后取第4代细胞,分成空白对照组、LPS组、LPS+LF组。空白对照组不加任何刺激,LPS组加入0.1μg·mL-1 LPS;LPS+LF组在加入0.1μg·mL-1 LPS 2 h后,加入10μg·mL-1 LF。以加入LF时开始计算时间,4 h后采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测hPDLCs中TLR4 mRNA的表达,24 h后采用细胞免疫荧光染色法观察TLR4蛋白的表达。结果 RT-PCR检测显示:LPS+LF组TLR4 mRNA表达较LPS组明显降低(P<0.05),与空白对照组无明显差异(P>0.05)。细胞免疫荧光染色法显示:LPS+LF组TLR4蛋白的表达强度较LPS组减弱(P<0.05),与空白对照组无明显差别(P>0.05)。结论 LF可以下调LPS激发的hPDLCs中TLR4的表达,在牙周炎症TLR4信号通路的调控过程中有一定的作用。

软脂酸增加血管内皮细胞Toll样受体4表达及活化TLR4炎症信号通路

目的研究饱和脂肪酸软脂酸对血管内皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达及信号转导的影响。方法采用软脂酸处理猪髋动脉内皮细胞(PIECs),实时荧光定量PCR检测PIECs TLR4 mRNA表达,蛋白印迹法检测PIECs TLR4及IκBα蛋白表达,流式细胞仪检测PIECs细胞表面TLR4蛋白水平,酶联免疫吸附测定法检测细胞培养液TNF-α及IL-6水平。结果与对照组比较,软脂酸组PIECs TLR4 mRNA及蛋白表达显著升高(TLR4 mRNA:4.73±0.61 vs 1.25±0.90,P<0.05;TLR4蛋白:5.79±0.05 vs4.07±0.31,P<0.05),PIECs细胞表面TLR4蛋白水平显著增加(38.070±3.907 vs 29.390±1.072,P<0.05);软脂酸组PIECs IκBα蛋白表达显著降低(2.04±0.22 vs 3.98±0.18,P<0.05),细胞培养液TNF-α及IL-6水平显著升高(TNF-α:2.52±0.30 vs 1.38±0.26,P<0.05;IL-6:3.28±0.32 vs 1.44±0.28,P<0.05)。结论软脂酸在诱导血管内皮细胞TLR4表达的同时活化TLR4炎症信号通路。

rno-miR-30b-5p在葡萄膜炎发病过程中对白细胞介素-10和Toll样受体4表达的调控作用

目的探讨rno-miR-30b-5p在葡萄膜炎中对白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)表达的调控作用。方法构建IL-10、TLR4基因的3’端非编码区域(3’UTR)荧光素酶质粒载体以及结合位点突变质粒载体,将rnomiR-30b-5p模拟物(mimic)与构建好的报告基因载体共转染293T细胞,通过报告基因相对荧光值的表达改变检测rno-miR-30b-5p对IL-10、TLR4表达的调控作用;制备实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)模型,通过注射视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白乳糜液,在造模后12 d分离EAU大鼠的脾脏和淋巴结,实时荧光定量PCR检测rno-miR-30b-5p和IL-10、TLR4基因的表达情况;ELISA检测IL-10和TLR4蛋白的表达情况。结果双荧光素酶报告基因表达结果表明,经rno-miR-30b-5p mimic干预后IL-10、TLR4野生型的报告荧光有明显的下调作用,对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光也存在明显的下调作用,与阴性对照相比,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果发现rno-miR-30b-5p在EAU大鼠脾脏和淋巴结中的表达均较对照组明显降低(均为P<0.01),而IL-10 mRNA、TLR4 mRNA表达明显升高(均为P<0.01);ELISA检测发现IL-10、TLR4蛋白表达升高,与对照组相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论rno-miR-30b-5p对带有IL-10、TLR4基因片段3’UTR基因表达的调控作用可能不是通过预测到的位点起作用而是通过其他的调控结合位点发挥作用;rno-miR-30b-5p在EAU大鼠脾脏和淋巴结的下调表达导致IL-10和TLR4的表达水平升高,进而调控葡萄膜炎的发展。本研究为进一步探索microRNA在葡萄膜炎发生发展进程中的调控作用、治疗葡萄膜炎奠定了基础。

木兰脂素对肾缺血再灌注损伤大鼠Toll样受体4表达的影响

目的:观察木兰脂素对大鼠肾缺血再灌注损伤时肾组织Toll样受体4(TLR4)表达的影响。方法:采用大鼠肾缺血再灌注损伤模型,雄性SD大鼠45只随机分为假手术组(n=5)、对照组(n=20)和治疗组(n=20)。于再灌注开始前5min静脉注射木兰脂素2mg/kg或等量生理盐水。再灌注达相应时间点时,从各组大鼠取血备测血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)以及血清细胞间黏附分子-1水平,肾组织用于观察病理变化以及作免疫组化分析肾组织TLR4表达情况。结果:治疗组BUN、Cr较相应时间点对照组明显降低,肾组织损伤也较对照组明显减轻。治疗组肾组织TLR4阳性表达多于假手术组,但较对照组明显减少。结论:木兰脂素预处理可减轻肾缺血再灌注损伤,其机制可能是通过抑制TLR4的表达而发挥作用的。

冠心病患者外周血单个核细胞Toll样受体4表达的测定及临床意义

目的:观察Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达水平,并探讨其与冠状动脉粥样硬化发生发展的关系。方法:流式细胞术检测50例冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)患者及40例健康对照者PBMCs TLR4的表达;生化常规测定所有入选者血脂水平;应用TaqMan荧光探针技术建立实时荧光定量RT-PCR方法,在GeneAmp 5700型检测仪上测定了入选对象PBMCs中TLR4 mRNA的含量。结果:PBMCs的阳性率为(29.5±7.9)%,显著高于健康对照组的阳性率[(23.4±7.7)%,P<0.01];冠心病组TLR4 mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(5.3±3.8)×106vs(1.8±1.4)×106,P<0.01];而冠心病血脂正常组和血脂异常组的TLR4阳性率和mRNA平均拷贝数均无明显差异。结论:TLR4主要表达于外周血单个核细胞,在CAD患者中其阳性率升高;CAD患者TLR4 mRNA的含量显著高于健康对照组;TLR4的阳性率和mRNA含量高低与血脂无关;TLR4及其介导的天然免疫应答与动脉粥样硬化的发生发展存在一定的相关性。

混合游离脂肪酸对大鼠肺微血管内皮细胞Toll样受体4表达的影响及其介导的炎症反应机制

目的研究混合游离脂肪酸(FFA)对大鼠肺微血管内皮细胞(RRPMVECs)Toll样受体4(TLR4)的激活作用及其介导的链式炎症反应机制。方法以不同浓度的FFA处理体外培养的RPMVECs,Western blotting检测TLR4蛋白的表达。用干扰小RNA(siRNA)转染体外培养的RPMVECs(TLR4 siRNA组和杂序siRNA组),设立阴性对照组。分别用0.1 mmol/L FFA、10 ng/mL脂多糖(LPS)和5 ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理各组细胞,以未加药细胞作为相应的空白组。Real-Time PCR检测TLR4 mRNA和NF-κB抑制蛋白激酶β(IKKβ)mRNA的表达,Western blotting检测磷酸化核因子κB抑制因子(p-IκBα)和核因子κB(NF-κB)的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子白介素-1β(IL-1β)的表达。结果 RPMVECs的TLR4蛋白相对表达量在0.1 mmol/L FFA处理后显著增高(P<0.05),并随FFA浓度的升高而增加。在杂序siRNA和阴性对照组,TLR4 mRNA的相对表达量在LPS和FFA处理后显著升高(P<0.05),TNF-α处理无明显变化;而在TLR4干扰组,3种处理后TLR4 mRNA的表达均无显著变化。在杂序siRNA和阴性对照组,3种方式处理后RPMVECs的IKKβmRNA、p-IκBα及IL-1β的相对表达量均显著升高(P<0.05),而TLR4 siRNA干扰抑制了其在FFA和LPS处理组的表达,但对TNF-α组无抑制作用。结论 FFA通过TLR4/IKKβ/NF-κB信号通路介导RPMVECs的炎症反应。

Toll样受体4表达与膝骨关节炎软骨细胞凋亡的关系

目的:探讨Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)表达与人膝骨关节炎软骨细胞凋亡的关系,明确TLR4介导的信号通路在骨关节炎发病机制中的作用。方法:取骨关节炎晚期行膝关节置换的关节软骨,剪碎后,采用酶消化法消化细胞,将处于对数生长期第3代细胞随机分为ZVF组、喜树碱对照组和阴性对照组,培养4周后,TUNEL法测定各组细胞凋亡情况,然后采用免疫组化染色和蛋白质印迹测定软骨细胞的TLR4蛋白表达。将软骨细胞随机分为对照组和TLR4抑制剂组,采用流式细胞仪和Caspase-3试剂盒测定两组细胞的凋亡情况。结果:用凋亡抑制剂ZVF和凋亡诱导剂喜树碱刺激体外培养的膝骨关节炎软骨细胞,培养4周后,蛋白质印迹结果显示喜树碱组TLR4蛋白表达最多,阴性对照组其次,ZVF组较阴性对照组的TLR4蛋白表达明显降低。免疫组化染色可见喜树碱组TLR4染色阳性细胞基本充满视野,荧光强度强;而阴性对照组可见一定数量染色阳性细胞,荧光强度一般;ZVF组只可见少量染色阳性细胞,荧光强度弱。流式细胞术结果显示TLR4抑制剂组软骨细胞凋亡率明显低于正常对照组;Caspase-3活化度检测结果同流式细胞术结果一致。结论:凋亡软骨细胞较正常软骨细胞的TLR4表达增加,而阻滞TLR4信号传导通路能有效抑制软骨细胞的凋亡。TLR4信号通路参与了软骨细胞的凋亡,在骨性关节炎的发病及进展中起着重要作用。

机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4表达的影响

目的 探讨机械通气对大鼠肺泡巨噬细胞（AM）表面Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法 清洁级成年雄性SD大鼠18只，随机分为自主呼吸组（R组，n=6）、小潮气量（VT）机械通气组（M组，n=6）和大VT机械通气组（N组，n=6）。腹腔注射质量分数为20％的乌拉坦8mg／kg麻醉大鼠，行气管插管。机械通气呼吸机参数设定：M组：VT为6ml／kg，N组VT为40ml／kg，吸：呼为1：1，呼气末正压（PEEP）为0，吸入氧浓度（FiO2）为0．21。调整呼吸频率和潮气末二氧化碳分压（PETCO2）维持在35～45mmHg（1mmHg=0．133kPa）。实验3h结束，放血处死大鼠。监测实验开始及实验1、2和3h时动脉血气分析；并测定大鼠肺组织病理形态学积分、湿／干重（W／D）比值及支气管肺泡灌洗液（BALF）中自细胞计数（WBC）和肺蛋白通透性系数。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定AM表面的TLR4mRNA表达，用免疫组化法测定AM表面的TLR4蛋白表达。结果 N组实验1h时存在过度通气，pH升高、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）降低（P均〈0．05），其他指标都在正常范围内。与R组比较，N组肺组织病理形态学积分、W／D比值，BALF中WBC和肺蛋白透性系数以及TLR4蛋白表达和TLR4mRNA表达均显著升高（P均〈0．01）；M组改变差异均无显著性（P均〉0．05）。结论 大VT机械通气导致大鼠肺损伤，并使AM表面TLR4表达明显上调。小VT机械通气可避免上述改变的发生。

重组人生长激素对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、一氧化碳产生及Toll样受体4表达的影响

目的研究重组人生长激素(rhGH)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、一氧化氮(NO)生成及Toll样受体4(TLR4)表达的影响以探讨rhGH的免疫调节作用。方法采用Griess反应、中性红吞噬实验及RT-PCR法分别测定不同剂量(1、3、25和100μg/L)rhGH作用的小鼠腹腔巨噬细胞的NO生成量、吞噬功能及TLR4的表达。结果结果显示3μg/L rhGH可显著促进小鼠腹腔巨噬细胞的NO生成量及TLR4的表达,增强巨噬细胞吞噬中性红能力。结论rhGH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、NO产生及TLR4表达有显著的调节作用,这种调节作用呈现剂量相关性,为rhGH的合理应用提供一定的实验基础。

栀子苷下调Toll样受体4表达并拮抗脂多糖诱导的小胶质细胞炎性反应

目的:观察栀子昔对细菌脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎性反应的影响并探讨其作用机制。方法:LPS诱导BV2小胶质细胞活化,CCK-8方法检测细胞存活率,Griess法测定NO释放量,ELISA测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量,免疫印迹检测Toll样受体4(TLR4)蛋白表达。结果:栀子苷在10～100μg/ml浓度范围内对小胶质细胞活力影响不显著,此浓度范围内,栀子苷剂量依赖性的减少LPS诱导的NO、TNF-α和IL-1β释放。此外,栀子苷还可抑制LPS诱导的BV2细胞形态活化改变,并降低LPS诱导的TLR4蛋白表达。结论:栀子苷可以拮抗LPS诱导的BV2小胶质细胞炎性反应,其机制可能与下调TLR4信号通路有关。