Tollip敲除猪肾细胞系的构建

旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后利用CCK-8试剂盒测定Tollip缺失后细胞活力变化,确认敲除细胞与野生细胞无显著差异,用FMDV感染敲除细胞后,采用Western blot、间接免疫荧光、实时荧光定量和病毒滴度测定等方法测定病毒在敲除细胞系中复制情况。结果显示:感染FMDV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的复制。综上,在PK-15细胞上,成功构建Tollip缺失细胞系,且试验表明Tollip的缺失有助于FMDV的复制。研究结果为后续Tollip功能研究及抗病毒机制研究提供理论依据。

TOLLIP基因3′侧翼区的群体遗传多态分析

为了寻找TOLLIP基因的突变位点,揭示中国荷斯坦牛的群体遗传特征。以中国荷斯坦牛群体66头个体为研究对象,用PCR方法扩增了牛TOLLIP基因3′侧翼区的部分片段,通过直接电泳与测序相结合的方法检测该片段的多态性,计算基因型频率,基因频率和多态信息含量,分析该多态位点在中国荷斯坦牛群体中的遗传特征。结果表明,该扩增片段的第43 bp处存在5个碱基(TCGGG)的缺失,致使多态性产生。其AA,AB和BB的基因型频率分别为0.3485,0.5152和0.1364;A等位基因(243 bp)和B等位基因(238 bp)的频率分别为0.6061和0.3939;多态信息含量和杂合度分别为0.3635和0.4775,表明该缺失突变在中国荷斯坦奶牛群体中处于中度多态;χ2适合性检验结果表明,中国荷斯坦牛群体在该位点的缺失突变未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

Toll作用蛋白(Tollip)在急性阑尾炎时的表达

目的分析Toll作用蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)在阑尾组织的表达及其在急性炎症中的意义。方法选择急性阑尾炎33例,以无炎症阑尾6例作对照(阑尾组织无炎性病理改变);阑尾切除术前1h检测脉搏、体温(BT)、白细胞(WBC)计数和中性粒细胞(NEUT)计数;阑尾标本经H-E染色和病理检查确诊后分为4组(A组无炎症,B组单纯性炎症、C组化脓性炎症、D组坏疽性炎症),采用免疫组化染色和数字图像分析法对Tollip的蛋白表达进行定性、定位和半定量分析,并统计分析Tollip与脉搏、BT、WBC及NEUT的相关性。结果按照病理类型分组,组间BT、WBC和NEUT存在显著差异(P<0.05);中性粒细胞低表达或不表达Tollip,Tollip主要表达于阑尾黏膜上皮和腺上皮细胞;阑尾从无炎症状态到发生单纯性炎症、化脓性炎症以及坏疽性炎症的过程中,Tollip的表达逐步升高,并与WBC显著相关(P<0.05)。结论在急性阑尾炎发生和发展过程中,阑尾组织局部的Tollip表达上调并与WBC升高等炎症全身反应密切相关。

牛Tollip基因编码区克隆及功能分析

采用RT-PCR和测序相结合的方法克隆了牛Tollip基因,并采用生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的结构和功能。结果表明:获得了2 619bp的cDNA序列,其中第52～873bp为编码区,编码273个氨基酸,其蛋白质的分子量为30.08kD,等电点为5.30,含有C2结构域(51～151aa)和CUE结构域(228～270aa),位于细胞核、细胞质、线粒体和内质网等多种细胞器上。牛Tollip蛋白与人、小鼠、大鼠、狗和鸡的Tollip蛋白的同源性分别为:91%、93%、93%、94%和89%,结构域部分高度保守。鉴于牛Tollip蛋白与人的高度同源,推测牛Tollip在TLRs介导的细胞信号转导中起着重要的功能,也可能是维持免疫细胞处于静止状态的重要分子。