荷花MYB蛋白靶基因NnTOM1的克隆及功能分析

【目的】从荷花(Nelumbo nucifera)中克隆NnTOM1基因,并进行生物信息学分析、基因表达模式分析以及烟草遗传转化,为进一步研究NnTOM1基因的功能奠定基础。【方法】通过克隆获得NnTOM1基因,对其蛋白序列进行理化性质和保守结构域预测等生物信息学分析,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析其组织特异性表达,并利用烟草遗传转化初步验证其生物学功能。【结果】NnTOM1基因编码区(Coding squence,CDS)长度为1191 bp,编码396个氨基酸,蛋白质分子式为C_(1918)H_(3130)N_(560)O_(589)S_(16),二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,含有TOM家族保守结构域(VHS-ENTH-ANTH和GAT),定位于细胞质中;多重序列比对及系统进化树分析表明,其与澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、蒂罗花(Telopea speciosissima)、博落回(Macleaya cordata)亲缘关系较近且序列一致性较高;qRT-PCR结果显示,NnTOM1基因在瓣化雄蕊中表达量最高,在根中表达量最低,且在重瓣型品种中表达量比单瓣型品种高;与野生型相比,NnTOM1转基因株系的花瓣颜色加深,花瓣先端变尖,花瓣间隔处加宽,花丝变长且明显长于花柱;且OE-1株系比野生型多出1片花瓣,表现出6片花瓣的表型。【结论】荷花NnTOM1基因可能参与荷花花器官的发育,为后续解析NnTOM1基因的功能提供了初步依据,也为荷花新品种选育提供了新的基因资源。

人类重组免疫球蛋白λ轻链022与TOM1基因在2型糖尿病胰岛素抵抗患者网膜脂肪组织的表达

目的:探讨人类重组免疫球蛋白λ轻链(HSIGVL)022和TOM1基因在2型糖尿病胰岛素抵抗(T2DM-IR)患者网膜脂肪组织表达水平并鉴定HSIGVL022蛋白表达。方法:取2型糖尿病伴胰岛素抵抗(T2DM-IR组)与非糖尿病无胰岛素抵抗者(对照组)网膜脂肪组织,用荧光定量RT-PCR技术测定HSIGVL022和TOM1 mRNA的表达量,用免疫组化方法鉴定HSIGVL022蛋白表达。结果:荧光定量RT-PCR显示HSIGVL022和TOM1 mRNA的表达量T2DM-IR组和对照组分别为(34 140±6 160)(、4 440±617)和(5 930±661)(、1 360±82)拷贝/每百万看家基因(P<0.05);HSIGVL022较TOM1表达量高(P<0.01),且与HOMA-IR呈直线相关(P<0.05);免疫组化显示HSIGVL022蛋白在T2DM-IR组和对照组阳性率分别为(12.43±2.41)%(、2.31±0.48)%,强阳性率分别为(6.62±1.69)%(、2.12±0.34)%,P<0.05。结论:HSIGVL022和TOM1在人网膜脂肪组织中均有表达,HSIGVL022表达量较高;在T2DM-IR者中均呈上调表达,HSIGVL022蛋白表达相应增高;HSIGVL022 mRNA表达量与HOMA-IR呈直线相关;这2条基因可能与T2DM-IR有关。

miR-214通过抑制TOM1表达促进肝星状细胞活化和迁移

背景:肝星状细胞(HSCs)持续激活所致的细胞外基质过度沉积是肝纤维化发生、发展的关键环节。MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的生物调节分子,为HSC的分化、增殖、凋亡、脂肪蓄积以及胶原生成所必须。既往对HSCmiRNAs表达谱的分析显示,miR-214在HSC活化过程中表达显著增高。目的:探讨miR-214在HSC中的生物学功能及其可能机制。方法:以real time PCR检测静息和完全活化状态大鼠HSC的miR-214 mRNA表达;应用miR-214封闭慢病毒载体感染HSC以敲除miR-214表达,以Transwell细胞迁移实验、蛋白质印迹法检测感染前后HSC迁移、活化能力的变化;应用荧光质粒报告系统对TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测的miR-214靶基因进行验证。结果:miR-214 mRNA在HSC活化过程中表达显著增高(P<0.01)。miR-214敲除组HSC Transwell小室迁移细胞数较阴性对照组显著减少(P<0.001),HSC活化标记物α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白表达显著下调(P<0.01)。预测显示TOM1为miR-214的靶基因,并得到荧光质粒报告系统证实;miR-214敲除组HSC TOM1蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论:miR-214参与促进HSC的活化和迁移,进而促进肝纤维化进程;miR-214在HSC中的生物学功能至少部分是通过抑制TOM1表达实现的。

Tom1L1在细胞信号转导及受体内吞中的研究进展

Tom1L1(Tom1 like 1)参与并调节细胞信号转导及受体运输通路。在不同细胞中Tom1L1对信号转导具有不同的调节作用。Tom1L1-CHC(clathrin heavy chain)复合物减少Src蛋白在小窝(caveolae)处富集,从而阻碍Src蛋白与血小板衍生因子(platelet derived growth factor,PDGF)受体的结合,抑制PDGF受体介导的有丝分裂和转化信号传导。活化的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通过Src家族蛋白激酶(src family kinase,SFK)磷酸化Tom1L1,磷酸化的Tom1L1通过Grb2和Shc的桥梁作用与EGFR结合,介导EGFR的内吞进程。Tom1L1和Hrs(hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate)、TSG101(tumor susceptibility gene101)的相互作用表明,它也可能参与了泛素化蛋白分选入多泡体的过程。该文就其在细胞信号转导通路及受体内吞/分选过程的作用作一综述。

长链非编码RNA YLB调控多个亚端粒区域基因的表达

目的 探讨一种自身表达受HECT类泛素连接酶Huwel/Tom1负调控的长链非编码RNA YLL066W-B（简称YLB）对亚端粒区域基因表达的调控作用。方法 建立Tom1基因敲除酵母菌株,采用实时定量PCR和基因芯片的方法检测Tom1敲除对基因表达的影响。构建表达YLB-HA、HA-YLB、pYES2-HA-YLB酵母菌株并结合测序、免疫印迹实验分析YLB的表达产物。通过实时定量PCR分析YLB敲除或过表达对酵母亚端粒区域多个基因转录水平的影响。结果 Tom1的敲除明显改变众多基因的表达,包括上调参与细胞周期调控基因YLB的表达。免疫印迹检测不到YLB所翻译的蛋白质,结合针对YLB的核苷酸序列的分析结果,推测YLB的转录产物是一种长链非编码RNA（lnc RNA）。NCBI检索结果显示,YLB不与其它基因的编码序列同源,但与pau和DNA解旋酶Yrf家族等多个亚端粒区域基因编码区的上下游调控序列同源。实时定量PCR分析发现YLB敲除上调Yrf1-4、pau4和pau22 mRNA的表达水平,但其过表达则下调这些基因的表达。结论发现了一种新的长链非编码RNA YLB,其转录受Tom1负调控,而其自身可以调控多个亚端粒区域基因的表达。

p16^(INK4A)诱导的衰老相关基因表达差异

目的 检测衰老主导基因 p16与衰老相关基因 p2 1、CSIG、TOM 1间的相互关系。 方法 正、反义 p16转染人胚肺 2倍体成纤维细胞 (2BS)后 ,用RT -PCR检测 p2 1、CSIG、TOM 1的表达 ,用WesternBlot检测 p2 1蛋白的表达。 结果 p16对p2 1存在转录后调控作用 ,正义 p16转染细胞TOM 1高表达 ,反义p16转染细胞CSIG高表达。 结论 衰老主导基因 p16与衰老相关基因p2 1、CSIG、TOM 1间存在相互作用 ,进一步说明了 p16在衰老中的主导地位。

怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因克隆和功能分析

为揭示怀玉山三叶青TOM2BisoformX1(tobamovirusmultiplicationprotein2BisoformX1)的生物学功能提供理论依据,本研究通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆了该基因,并采用生物信息学、转基因瞬时表达和实时定量PCR方法对其进行序列分析、亚细胞定位、组织表达分析和功能分析。结果表明,怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因cDNA总长度为432bp,G+C含量为50.46%;编码143个氨基酸,分子量15392.36Da,等电点7.87,为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋(50.35%)、β-片层(2.10%)、无规则卷曲(47.55%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青TOM2BisoformX1主要存在于细胞核中;怀玉山三叶青TOM2BisoformX1与葡萄(Vitis vinifera)TOM2BisoformX1(GenBank:XP_010664025.1)的同源性最高,达到83.92%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,TOM2BisoformX1定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,TOM2BisoformX1基因在怀玉山三叶青两个栽培种中的表达存在器官特异性,‘怀玉2号’和‘怀玉1号’均在叶中表达量最高;TOM2BisoformX1转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于TOM2BisoformX1转基因阴性烟草;与转基因阴性烟草相比,转基因阳性烟草的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)及电子传递效率(ETR)显著下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青TOM2BisoformX1具有典型TOM2BisoformX1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守,且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖,降低植株的光合作用效率。