稳定过表达TOX3的乳腺癌MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建人TOX高迁移率蛋白家族成员3(TOX3)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达TOX3的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系。方法通过全基因合成法合成TOX3基因序列片段,并进行PCR扩增。将TOX3基因克隆到pLVEF-1a/GFP-Puro载体中,构建pLVEF-1a/GFP-Puro-TOX3慢病毒载体。经酶切和测序鉴定后,将构建好的慢病毒载体进行病毒包装和病毒滴度检测。用获得的慢病毒液转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过嘌呤霉素选择性培养,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞中TOX3 mRNA的表达,Western blot法检测MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达。结果经酶切和测序鉴定,成功构建了pLVEF-1a/GFP-Puro和pLVEF-1a/GFP-Puro-TOX3慢病毒表达载体,病毒包装后检测病毒滴度分别为2×108TU/mL和1×108TU/mL,转染MDA-MB-231细胞后,GFP表达的细胞达95%以上。与阴性对照组相比,qRT-PCR和Western blot结果显示,MDA-MB-231-TOX3细胞中TOX3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。结论成功构建了TOX3慢病毒表达载体并建立了稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞系。

尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征

为了解析与胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白4(tox high mobility group box family member 4,TOX4)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)响应无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染过程中的功能,利用聚合酶链式反应(PCR)克隆和鉴定尼罗罗非鱼TOX4基因(GenBank登录号:XP003458812)的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,对推导的TOX4氨基酸序列进行生物信息学分析,分析其亚细胞定位特征,以及在尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞亚群的分布特征,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析TOX4基因在健康鱼各组织及响应无乳链球菌感染过程中的表达模式。结果表明:尼罗罗非鱼TOX4基因的ORF全长为2004 bp,编码667个氨基酸,预测TOX4蛋白的相对分子质量为69060,理论等电点为4.69,无信号肽序列及跨膜结构,具有一个HMG保守结构域;亚细胞定位结果显示,TOX4蛋白主要表达于细胞核中;多序列比对及系统进化分析均显示,尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)TOX4氨基酸序列的同源性最高;qRT-PCR分析显示,TOX4基因在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,且在血液中表达量最高;单细胞转录组数据分析显示,TOX4基因主要在尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(nonspecific cytotoxic cell,NCC)和巨噬细胞(macrophage,Mφ)中表达;经无乳链球菌感染后,尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏中TOX4基因的表达量显著上调,并在感染后12 h(脑、头肾、肠道)和48 h(脾脏)达到峰值。研究表明,TOX4可能参与尼罗罗非鱼响应细菌感染的免疫应答过程。

miR-223下调NLRP3炎性体表达抑制人血管平滑肌细胞分泌高迁移率族蛋白B1

目的探讨microRNA-223(miR-223)下调人动脉平滑肌细胞(human arterial smooth muscle cells,HASMCs)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)分泌的作用机制。方法利用我院严重外伤截肢患者或健康器官捐献者的正常动脉组织,通过组织块贴壁法分离原代HASMCs并通过免疫荧光进行鉴定;利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)及Western blot检测脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)联合腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)对HASMCs中NLRP3(NLR family pyrin domain containing 3)炎性体的激活作用;转染miR-223模拟物(miR-223mimic)进入HASMCs,利用RT-q PCR、Western blot检测靶基因NLRP3 mRNA、蛋白表达量及激活状态,利用双荧光素酶报告基因明确miR-223和NLRP3的调控关系,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测miR-223对HASMCs上清中HMGB1的含量影响。结果 LPS联合ATP可以激活HASMCs细胞内NLRP3炎性体(P<0.05),促进HMGB1胞外分泌(P<0.01);转染miR-223可以显著减少NLRP3mRNA及蛋白水平(P<0.05),通过双荧光素酶报告基因明确NLRP3为miR-223的直接靶基因;转染miR-223可以明显下调HASMCs上清的HMGB1水平(P<0.01)。结论 miR-223可以通过转录后水平下调HASMCs内NLRP3炎性体的表达及激活,从而抑制HASMCs分泌HMGB1。

多参数TOX免疫表型法的建立及在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤中的应用

目的:建立多参数流式检测胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞中的免疫表型法,以及其在1例罕见CD4-CD56^(+)表型的血液恶性肿瘤母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)患者中的应用分析。方法:收集1例BPDCN患者骨髓(BM)和外周血(PB),2例非肿瘤手术患者和1例健康者BM以及11例健康者(HI)PB分别作为BM和PB对照组,利用多色流式单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TOX、PD-1、Tim-3、CD244及相应同型对照进行流式细胞检测。结果:流式检测结果提示,BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)CD3^(+)、TOX^(+)CD4^(+)和TOX^(+)CD8^(+)T细胞比例均比对照组升高;BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)PD-1^(+)CD8^(+)、TOX^(+)Tim-3^(+)CD8^(+)和TOX^(+)CD244^(+)CD8^(+)耗竭性T细胞中的分布比例也显著高于对照组。此外,在BPDCN患者BM和PB的CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg细胞中TOX^(+)细胞分布比例高于对照组;同时TOX^(+)细胞在PD-1^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg、Tim-3^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg和CD244^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg耗竭性T细胞中的分布比例也明显高于对照组。结论:成功建立多参数流式细胞术检测PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞亚群中TOX免疫表型法,TOX可能是BPDCN患者T细胞免疫调节的重要转录因子。

痛风患者血小板来源NLRP3和高迁移率族蛋白1的表达水平及临床意义

目的探讨痛风患者血小板来源含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)与高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达水平,以及两者在痛风中的临床意义。方法收集2022年1月至2023年1月青海大学附属医院风湿免疫科痛风性关节炎(GA)男性患者25例,高尿酸血症(HUA)男性患者23例,同时于医院体检中心选取年龄相匹配的男性健康对照(HC)者15例。提取所有研究对象血小板,采用流式细胞术(FCM)检测血小板来源NLRP3、HMGB1的表达水平。同时收集所有研究对象的一般资料及实验室指标,并对NLRP3、HMGB1与其实验室指标进行Pearson线性相关和Spearman秩相关分析。结果GA组NLRP3、HMGB1阳性细胞率高于HUA组、HC组,HUA组高于HC组,差异有统计学意义(P<0.05)。GA组身体质量指数(BMI)、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、中性粒细胞计数(NEUT)、血小板计数(PLT)、血尿酸(UA)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(DD)水平高于HUA组、HC组,HUA组BMI、PLT、UA水平高于HC组(P<0.05);GA组饮酒比例、三酰甘油(TG)水平高于HC组,HUA组饮酒比例、TG水平高于HC组(P<0.05);GA组血小板平均体积(MPV)水平低于HC组(P<0.05)。GA组NLRP3阳性细胞率分别与ESR、CRP、NEUT、PLT、TG、UA、FIB、DD呈正相关,与MPV呈负相关(P<0.05);GA组HMGB1阳性细胞率分别与CRP、NEUT、PLT、TG、FIB、DD呈正相关(P<0.05);HUA组NLRP3阳性细胞率分别与PLT、TG、UA呈正相关(P<0.05);HUA组HMGB1阳性细胞率分别与PLT、TG呈正相关(P<0.05)。结论血小板来源的NLRP3、HMGB1可间接反映痛风患者体内炎症及疾病的活动程度,可能参与了痛风的发生及发展,或有望成为评估痛风的生物学指标。

miR-22-3p对人肺微血管内皮细胞HMGB1/NLRP3信号通路的调控作用

目的 探究微RNA-22-3p(microRNA-22-3p,miR-22-3p)调控HMGB1/NLRP3通路对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMEC)炎症反应的影响。方法 取腹腔感染导致的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者和健康对照者外周血行miRNA芯片分析,选定目标miRNA,在HPMEC中分别利用目标miRNA类似物和抑制剂进行预先处理,再利用LPS刺激,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCT)和蛋白印迹法检测高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)和Nod样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3,NLRP3)mRNA和蛋白的表达变化,采用RT-qPCT和酶联免疫吸附试验检测细胞和上清中的相关炎症因子水平。结果 miRNA芯片分析显示,miR-22-3p在ARDS患者的血浆中表达显著下调。与阴性对照组相比,转染miR-22-3p类似物后,HMGB1、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平明显降低,活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)水平显著减少。相应的,炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-1β的mRNA水平,细胞上清中炎症因子水平均显著降低(均P<0.05);转染miR-22-3p抑制剂后,HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白和炎症因子的表达水平显著上调(均P<0.05)。结论 miR-22-3p在腹腔感染导致的ARDS患者外周血中显著下调,可在HPMEC中抑制HMGB1/NLRP3信号通路,并抑制其下游炎症反应。