基于TP-M13-SSR指纹图谱的中国原产苹果属植物分子身份证的建立

利用TP-M13-SSR分子标记方法,构建27份中国原产苹果属植物在12个SSR位点的指纹图谱,并运用条码技术生成其分子身份证。12对引物共获得251个等位基因,平均21个。引物多态性好,仅用引物CH05b06即可区分全部供试材料。27份苹果材料在12个SSR位点遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度的变化范围分别为0.6620~0.9455、0.6327~0.9211和0.6538~0.9319。基于CH05b06位点处获得的指纹谱图即可得到每份供试材料独有的分子身份证。TP-M13-SSR分子标记技术适用于苹果属植物种质资源的指纹图谱构建,利于分子基础数据库的积累。基于苹果种质资源TP-M13-SSR指纹图谱可获得每份苹果种质资源独有的分子身份证。

TP-M13-SSR技术及其在苹果种质资源遗传多样性研究中的应用

利用在SSR扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系TP-M13-SSR,对苹果种质资源的25份地方品种进行了遗传多样性研究,得到其遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度的变化范围分别为0.5032～0.8448、0.3952～0.8268和0.4400～0.9600。UPGMA法聚类分析将25个苹果品种分为2大类,与地理起源和亲缘关系相关。这种方法具有经济、灵敏、高效等优点,在苹果遗传多样性研究中得到成功应用。本文讨论了TP-M13-SSR技术的优缺点,以及在果树种质资源遗传多样性研究中的应用潜力。

TP-M13-SSR技术在梨遗传多样性研究中的应用

利用在SSR扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)对5个种25份梨种质资源材料进行了SSR标记的遗传多样性研究。利用NH013a和NH007b 2对引物即可区分所有供试品种,5对引物的区分率平均为76%。25份材料在5个SSR位点的遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度的变化分别为0.656 0～0.834 60、0.639 8～0.814 9和0.434 8～1.000 0。新疆梨的遗传多样性水平和多态性信息含量最低,平均值分别为0.716 0和0.681 2;秋子梨最高,平均值分别为0.772 0和0.737 9。TP-M13-SSR方法具有经济、灵敏、高效等优点,在梨遗传多样性研究中应用效果好。

TP-M13-SSR技术在枸杞遗传多样性研究中的应用

利用在SSR扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系TP-M13-SSR对29份枸杞种质资源进行遗传多样性研究。13对引物共检测到78个等位基因,平均每个位点6个等位基因。群体平均的主等位基因频率(MAF)、有效等位基因数(NE)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、Shannon’s信息指数(I)和多态信息含量(PIC)分别为0.625、2.684、0.401、0.514、1.103和0.487。聚类分析表明:29份枸杞种质间相似系数为0.66~0.97,平均相似系数为0.81;供试材料可分为5大类7亚类。研究表明,供试材料的遗传相似性较高,遗传多样性较低。TP-M13-SSR方法具有经济、灵敏、高效等优点,在枸杞遗传多样性研究中应用效果好。

基于TP-M13-SSR分子标记技术的133份薄皮甜瓜种质资源遗传多样性分析

【目的】分析我国不同省(区)的薄皮甜瓜种质资源遗传多样性,为今后薄皮甜瓜的种质资源收集及遗传改良和高效利用提供理论依据。【方法】以来自我国不同省(区)的133份薄皮甜瓜种质为材料,从98对SSR引物中筛选得到12对多态性较高的引物,利用TP-M13-SSR分子标记技术对133份薄皮甜瓜种质材料进行遗传多样性分析,并根据Nei’s遗传距离(D)进行聚类分析,以Structure软件的混合模型聚类法分析其群体遗传结构。【结果】利用12对引物从133份薄皮甜瓜种质材料中共扩增出的等位基因数(Na)为54个,平均每对引物4.5个,有效等位基因数(Ne)为1.120~2.234,平均为1.533;观测杂合度(Ho)为0.023~0.466,平均为0.217;期望杂合度(He)为0.107~0.552,平均为0.319,香农信息指数(I)范围为0.267~1.237,平均为0.642;各位点的多态性信息含量(PIC)为0.104~0.531,平均为0.295,大多数位点表现为中度多态性。聚类分析结果显示,133份薄皮甜瓜种质材料被分为两大类群,第Ⅰ类群为4份厚薄皮甜瓜材料,第Ⅱ类群为129份薄皮甜瓜材料。群体遗传结构分析结果显示,当K=4时,△K出现明显的峰值,说明133份薄皮甜瓜种质材料分为4个组群较合适;133份材料中大部分材料的Q值大于0.6。【结论】供试的12对SSR引物表现为中度多态性,需要用更多的分子标记才能有效鉴别薄皮甜瓜材料。133份薄皮甜瓜种质材料遗传结构较为单一,遗传多样性较低,可能存在同物异名的材料,今后应加强对遗传背景差异大、亲缘关系远的种质资源的发掘利用。

TP-M13自动荧光法的改进及在美国山核桃品种鉴定上的应用

用TP-M13自动荧光法检测了常用10个美国山核桃品种中的8个SSR位点,发现原有直接使用三引物方法扩增的有效性和可靠性较低,而经过改进的间接三引物法则有较大的实用价值,在此基础上进一步研究后认为混合三引物法在适当控制混合引物的对数和提高特异性后,在提高间接三引物法的扩增效率方面是可行的。

新疆野扁桃的TP-M13-SSR荧光标记引物的筛选

为对毛细管荧光电泳检测过程中出现的非特异性峰进行观察,探讨其形态及发生原因,笔者从新疆野扁桃的5个居群中分别挑选2份叶片提取基因组DNA,PCR产物使用毛细管电泳荧光检测。结果表明:在毛细管电泳荧光检测中,共选用4种荧光引物,其中荧光引物FAM峰型最为正常且特异峰清晰,不常发生非特异性峰。与之相反,荧光引物ROX的非特异峰种类数量最多,且特异峰不易辨认。在6种异常情况中,N+1峰出现次数最多,高低峰出现次数最少。荧光引物FAM更适合于新疆野扁桃进行扩增。

新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的多态性分析

以来自5个居群的96份新疆野扁桃叶片为试材,采用TP-M13-SSR技术和毛细管荧光电泳检测的方法,分析新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的多态性,以期为该珍稀植物的保育工作提供参考依据。结果表明:新疆野扁桃TP-M13-SSR引物库中包含23 627条序列,共有5类重复类型,以二核苷酸类型数量最多,五、六核苷酸数量极少。将12对核心引物与96份样品一同扩增后,等位基因数(No.of allele)均为2个,有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、固定指数(F)、香农指数(I)、特异等位基因(Na)、多态性信息含量指数(PIC)、标记指数(MI)、Nei′s多样性指数、遗传相似性系数(Gst)、基因流(Nm)的范围分别为:3.531 0~9.000 0、0~0.666 7、0.72~0.89、0.25~1.00、1.48~2.44、8~18、0.669 0~0.879 0、5.35~15.82、0.219 5~0.430 8、0.002 0~0.042 6、34.756 0~252.196 4。这12对引物中,引物PT-9的多态性最好,引物PT-1多态性最差。

新疆野扁桃TP-M13-SSR的引物开发研究

该试验自主设计新疆野扁桃TP-M13-SSR引物,从中筛选多态性最佳的引物以供后续研究使用。从该植物的5个居群中分别挑选2份叶片提取基因组DNA,扩增后的产物使用毛细管电泳荧光检测并分析。经分析可得出12对新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的期望杂合值(He)、观测杂合值(Ho)、等位基因数目(Na)、香农指数(I)、固定指数(F)、多态性信息含量指数(PIC)的范围分别为0.656~0.859、0~0.281、3.796~9.580、4~8、1.213~2.014、-0.164~1、0.605~0.843。在所有以上引物中,引物PT-6除固定指数外的所有信息数据均为最高。共筛选出12对多态性信息丰富的TP-M13-SSR引物,扩增片段大小在100~300 bp之间,多为两碱基重复。

TP-M13-SSR技术在麦芽品种鉴定中的应用

利用TP-M13-SSR标记技术构建麦芽品种指纹图谱,从163对简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)引物中筛选到4对多态性丰富的SSR引物,每对引物的等位基因为3～10个不等,平均每个引物产生6.75个等位基因。在大批量引物筛选的情况下,M13通用引物可大大降低SSR引物进行荧光标记的合成成本。利用4对SSR引物进行麦芽品种DNA指纹图谱构建,得到23个麦芽品种的指纹图谱及指纹数据库。该法检测成本低,方法准确可靠,可实现国内主要麦芽品种的鉴定,为啤酒企业在麦芽采购环节提供技术支持。

基于TP-M13-SSR标记的石斛兰种质分子身份证构建

利用TP-M13-SSR分子标记,以收集保存的29份石斛兰种质为试材,对其遗传多样性进行分析并构建分子身份证。14对SSR引物在29份种质间共检测出191个等位基因,引物检出率为79.31%~100%;引物多态性信息含量为0.3877~0.9484,平均0.7956;Shannon指数为0.8702~3.1553,平均2.1606。29份种质间的遗传相似性系数为0.3037~0.9005,在0.7000处可将全部种质分为6个类群。根据引物通用性和Shannon指数高低,从1对引物开始逐步增加引物数量筛选可将29份种质全部区分的引物组合,最终确定核心引物组合为DoeSSR5+DoeSSR87+DoeSSR97。基于这3对核心引物的扩增结果,将等位基因编码成字符串获得29份石斛兰种质独有、可辨的分子身份证。

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定。在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测。结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点。建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统。

利用TP-M13-SSR标记构建苹果栽培品种的分子身份证

以国家果树种质兴城梨、苹果圃保存的314份来自19个国家的苹果栽培品种为试材,利用TP-M13-SSR标记,基于TP-M13-SSR指纹图谱构建苹果种质分子身份证。16对SSR引物在供试种质间共检测出等位基因357个,平均每对引物检测到22.3个。根据引物扩增等位基因数和Shannon’s指数,从1对引物开始逐步增加引物数量筛选可将供试材料全部区分的引物组合,最终确定6对核心引物可以区分全部供试苹果种质。基于供试苹果种质在6个SSR位点的指纹图谱,将等位基因编码成字符串获得分子身份证,利用条码技术其进一步转化成可被机器快速扫描的条码分子身份证,使每份种质具有可辨的分子身份证,达到利用最少、最特异引物区分最多苹果种质的目的。

适宜加工用苹果品种TP-M13-SSR指纹图谱构建及遗传关系分析

采用TP-M13-SSR荧光标记方法,构建19个适宜加工脆片和25个适宜制汁的苹果品种在11个SSR位点的指纹图谱,并通过聚类分析研究其遗传关系。仅利用两对引物CH04h02和CH05d04即可区分44个供试品种,各品种的TP-M13-SSR指纹图谱互不相同。构建的适宜加工苹果品种的SSR指纹图谱可以作为品种特异指纹图谱为品种鉴别提供重要依据。44个苹果品种的相似系数在0.7259～0.9704之间,在相似系数0.798处划分供试品种,除瑞光、马空、红月、蜜脆、珍宝、赤阳和短枝金冠,其余适宜制汁的品种均聚到了一起,而适宜加工脆片的品种聚类比较分散。适宜加工苹果品种遗传基础广泛,适宜加工特性与亲本相关。在制订和完善制汁用和加工脆片用苹果品质评价体系时,需要兼顾遗传关系与加工特性的相关性。金冠、红玉、国光、富士和元帅等为较好的加工苹果品种的育种亲本,应加强育种利用。

利用TP-M13-SSR技术分析我国两个地方猪种的遗传多样性

采用TP-M13-SSR技术,检测了我国地方猪品种柯乐猪和藏猪近交群体在18个微卫星位点的遗传多样性。结果如下:1)TP-M13-SSR方法简单、准确、高效,优于聚丙烯酰胺凝胶电泳;2)18个微卫星座位在柯乐猪封闭群和藏猪近交群体中的平均有效等位基因数分别为3.5092±1.0545、2.6097±0.8811,平均观察杂合度分别为0.7597±0.1672、0.5966±0.2194,平均期望杂合度分别为0.7000±0.1138、0.5781±0.1522,平均多态信息含量分别为0.6413±0.1252、0.5086±0.1535,表明两个群体具有较高的遗传多样性和较大的遗传潜力,柯乐猪封闭群可作为保种群使用。结论:将TP-M13-SSR技术应用于我国地方猪品种的遗传多样性,为快速、大规模评估我国地方猪种遗传资源提供了新的方法。

苹果部分种质资源分子身份证的构建

【目的】以国家果树种质兴城梨、苹果圃保存的131份苹果地方品种、育成品种及其野生近缘种为试材,利用TP-M13-SSR标记构建苹果种质分子身份证。【方法】基于TP-M13-SSR指纹图谱,筛选可以将苹果种质区分的引物组合,并对其等位基因进行编码建立种质分子身份证。【结果】(1)从131份材料中随机选取两份材料,对第一次PCR条件进行优化和引物筛选,从32对合成引物中筛选出16对稳定性高和重复性好的TP-M13-SSR引物用于131份苹果属植物指纹图谱构建。(2)16对SSR引物在供试种质间共检测出等位基因326个,每对引物平均检测到等位基因数为20.3个。CH05d04对种质扩增的等位基因数最多为49个,位点期望杂合度最高为0.878;其次是CH01f07a为48个。利用Pop Gen32软件计算引物的多态性信息含量,16对引物的平均多态性信息含量为0.7558。16对SSR引物可区分供试苹果种质资源数量从11份到71份不等,平均每对SSR引物可区分49份苹果种质,区分率为8.09%—52.21%。其中对苹果种质区分率最高的是CH01f07a,最低的为BGT23b。(3)根据引物扩增的多态性信息含量和对苹果种质的区分率,将两者均较高的引物CH05d04、CH01f07a、CH03d07、CH04e03、CH04h02和CH04g07两两组合,CH04h02和CH01f07a引物组合分辨率最高,可以区分120份苹果种质。继续增加组合中引物数量,在增加到3对引物时,即可将全部苹果种质区分开来。(4)把可以将全部供试苹果种质资源材料全部区分的3对核心引物CH04h02、CH05d04和CH01f07a获得等位基因按照从大到小的顺序排列,并用阿拉伯数字从01开始赋值;将每份材料在3个位点获得的等位基因按照赋值数字编码获得每份供试材料独有的字符串,利用条码技术将每对引物的分子身份证转化成可被机器快速扫描的条码分子身份证。【结论】依据引物扩增的多态性信息含量和对苹果种质的区分率,筛选核心引物组合,区分全部供试苹果地方品种、育成品种及其野生近缘种质资源,并基于指纹图谱构建其可被机器快速识别的分子身份证,使每份种质具有可辨的分子身份证,达到利用最少、最特异引物区分最多苹果种质的目的。

杨树新品种的SSR指纹图谱构建和倍性检测

【目的】对24份杨树种质进行指纹图谱构建、系谱关系鉴定和遗传多样性分析，并进行倍性检测，为杨树新品种鉴定和知识产权保护提供科学的理论依据，同时为杨树的育种工作奠定坚实的基础。【方法】利用 TP-M13-SSR 技术对24份杨树种质进行指纹图谱构建和系谱关系鉴定。从杨树 SSR 数据库中选取200对 SSR 引物，利用遗传背景差异大的 4份杨树种质进行引物筛选，选出19对扩增条带清晰、具有多态性且重复性好的引物对24份杨树种质进行扩增，利用 GeXP 毛细管电泳对 PCR 荧光产物进行检测，采用非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，利用流式细胞术（FCM）进行倍性检测。【结果】19对 SSR 引物共扩增出102条条带，多态性条带97条，占95．10%，每个位点的等位基因数为2～11个，平均每对引物为5．37个。19对 SSR 引物均未检测到中林2025杨、中红杨和全红杨的条带差异，这3份种质相对于其他21份种质有特异的共同指纹条带；3对高效引物 ORPM_103，ORPM_180和 GCPM_1255可以将剩余21份杨树种质完全区分开。SSR 标记构建的指纹图谱与其系谱关系基本一致。对24份种质进行聚类分析，相似系数在0.50～1.00之间。当相似系数为0．56时，可分为5大类：第1类包括50号杨、中怀1号、中怀2号、I-69、帝国杨、中林2025杨、中红杨和全红杨；第2类包括青杨、森海 1号和森海 2号；第3类包括36号杨、丹红杨、南杨、239、1-116、中成 1号、中成 2号、中成3号、中成4号和中豫1号；第4类包括北抗杨和创新杨；第5类只有中林46杨。SSR 检测发现中怀 1号、森海 1号、森海 2号、青杨和中林46杨扩增出3个不同等位基因位点，其余19份杨树种质只出现 1个或2个等位基因位点；FCM 检测结果证实这5份种质均为三倍体，与 SSR 检测结果一致。【结论】本研究对24份杨树种质进行指纹图谱构建、遗传多样性分析和倍性测试，证实用 SSR标记可有效地检测亲本与子代之间的系谱关系，并准确地反映植物的倍性。筛选出 3对快速鉴别其中21份杨树种质的 SSR 引物，发现5个杨树种质为三倍体。本研究结果可为杨树新品种鉴定和知识产权保护提供理论依据。

基于SSR荧光标记的杧果种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

丰富的种质资源是杧果新品种选育和产业发展的基础。为保护和利用杧果种质资源,本研究利用课题组前期开发的TP-M13-SSR标记对杧果种质资源保护广西创新基地圃内保存的145份杧果地方品种、育成品种及其近缘野生种进行遗传多样性分析和分子身份证构建。结果表明:12对引物的平均观测等位基因数为3.2838、平均观察杂合度(H_(o))为0.5858、平均期望杂合度(H_(e))为0.6725、平均Shannon指数(I)为1.3383、平均Nei基因多样性指数(N_(a))为0.6702、多态信息含量(PIC)分布范围在0.5036~0.7827之间,平均值为0.6396,所有引物为高度多态性位点,说明TP-M13-SSR荧光引物可以为杧果的遗传多样性分析提供研究数据;145份材料的遗传相似性系数变化范围为0.5676~1.000,平均为0.7417,其中爱文与印度杧1号遗传相似性系数为1.000,扁桃杧田阳20-2与大头香杧、扁桃杧田阳20-2与硕帅杧、金煌杧与桂热杧10-1的遗传相似性系数最小,均为0.5676;在遗传相似性系数为0.7060时,145份种质分为2个类群,I类群包括108份杧果和20份扁桃,种质数量最多,占总数的88.9%,Ⅱ类群包括17份材料,全部为扁桃。在遗传相似性系数为0.7330时,I类群可进一步分为5个亚群,其中I-1和I-3亚群种质数量最多,占所有杧果的91.92%,UPGMA聚类分析表明扁桃未严格按照种属关系聚在一起,杧果的整体聚类结果与其地理来源基本一致;对145份材料的扩增产物进行SSR荧光标记毛细管电泳检测获得指纹图谱,采用数字和字母相结合的编码方式获得分子身份证,通过分子身份证进行种质鉴定,每一对引物可平均区分12.4份种质,鉴定率明显高于前人研究,表明TP-M13-SSR检测技术比目前广泛采用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术在杧果种质鉴定上更具优势。本研究结果为杧果及其近缘种种质资源的收集整理和新品种的选育提供科学依据。

杨树种质SSR指纹数据库构建

【目的】构建林木种质资源指纹数据库是林木种质材料遗传鉴定的前提,也可为林木杂交育种提供清晰的遗传学背景。【方法】选取亲缘关系较远的8份杨树无性系材料筛选SSR引物,基于TP-M13-SSR技术进行SSR-PCR扩增,采用ABI3730XL毛细管电泳系统检测PCR扩增产物,利用GeneMarkerV1.91进行基因分型,Cervus3.0.7估算多态信息含量(PIC)和各位SSR位点无效等位基因频率(pN),POPGENE3.2估算各SSR位点上的等位基因数目(Na)、Shannon信息指数(I)和观测杂合度(HO),NTSYS-pc2.1进行遗传聚类分析。【结果】共筛选出13对条带清晰、重复性好的SSR引物,共扩增出89条多态性条带,单个位点上的等位基因数目为2~12个,平均值为6.5个;Shannon’s信息指数(I)为0.13~1.91,平均值为0.97;多态信息指数(PIC)为0.19~0.81,平均值为0.56;观测杂合度为0.06~0.76,平均值为0.40。聚类分析结果表明,参试的无性系种质材料分为3类,第一类为南林系列无性系;第二类为中林108杨、中潜1号、中潜3-2、中驻2号、中驻4号、中驻6号、中驻7号、中驻8号、浙7、中皖1号、中皖2号、丹红杨、A65/27、南抗4、南抗3;第三类为湘林系列无性系。【结论】TP-M13-SSR分子标记技术能有效地鉴别杨树无性系种质,明晰无性系间亲缘关系,遗传聚类的结果与其谱系关系基本一致。研究结果为杨树无性系种质鉴定及进一步开展杨树杂交育种奠定了基础。

基于转录组序列的长柄双花木SSR标记开发

双花木属(Disanthus Maxim.)是金缕梅科(Hamamelidaceae)最原始的单种属,为东亚地区特有属。长柄双花木(D.cercidifolius var.longipes H.T.Chang)是日本特有植物双花木(D.cercidifolius Maxim.)的变种,仅分布于我国南方地区,为国家Ⅱ级保护植物,被列入我国濒危植物种名录,在研究金缕梅科系统发育和东亚植物区系地理演化等方面具有重要的科学价值。由于可利用的SSR标记引物数量不足,阻碍了长柄双花木遗传学研究。本研究对长柄双花木转录组序列进行高通量测序,采用de novo组装方法,共获得32325条unigene。利用MISA软件,搜索到13779个SSR位点,SSR位点发生频率为42.63%,位点分布频率为1/2.95 kb。不同重复基序类型中,二核苷酸重复基序数量最多,占总数44.10%;单核苷酸重复基序次之,占总数37.90%;三核苷酸重复基序,占总数16.71%。二核苷酸重复基序中,AG/CT重复基序数量最多;三核苷酸重复基序中,AAG/CTT重复基序数目最多,其次是ATC/ATG、ACC/GGT和AGC/CTG。从不同种群中任取1株构成8株无亲缘关系的随机样本,对随机合成的60对SSR引物的有效性进行琼脂糖电泳检测的结果表明,46对引物扩增出目的条带,扩增率达76.67%。进一步利用TP-M13-SSR技术基因分型结果显示,30对引物扩增产物显示出多态性,多态位点百分比为65.22%。这表明,基于转录组序列开发的长柄双花木SSR位点多态性较高。本研究结果有助于后续的长柄双花木种群遗传学及系统进化等方面研究。