下调TP53INP1基于PI3K/AKT/mTOR信号通路对宫颈癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响

目的分析下调肿瘤蛋白P53诱导性核蛋白1(TP53INP1)基于PI3K/AKT/mTOR信号通路对宫颈癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响。方法按照脂质体2000说明书对细胞进行转染TP53INP1 mimics及TP53INP1 inhibitor,按照实验设计,将其分为对照组及上调组(TP53INP1 inhibitor)、下调组(TP53INP1 mimics)。荧光定量PCR法检测TP53INP1表达量,采用细胞划痕实验法检测细胞迁移能力,采用流式细胞仪检测细胞凋亡能力,采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR通路中PI3K、AKT、mTOR表达量。结果上调组表达量高于下调组TP53INP1,差异有统计学意义(P<0.05);下调组凋亡率高于上调组,差异有统计学意义(P<0.05);下调组侵袭能力、迁移能力低于上调组,差异有统计学意义(P<0.05);下调组PI3K、AKT、mTORBax蛋白表达量低于上调组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TP53INP1在宫颈癌中呈现高表达,下调TP53INP1可抑制宫颈癌细胞侵袭、迁移,促进凋亡,其机制可能与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路相关。

鸡miR-20a靶基因TP53INP1鉴定

前期研究发现,过表达mi R-17-92基因簇能促进鸡前脂肪细胞增殖,但作用机制尚不清楚。生物信息学分析发现,TP53INP1是mi R-17-92基因簇成员mi R-17-5p和mi R-20a的潜在靶基因,研究采用荧光素酶报告基因技术和基因过表达技术开展该靶基因的验证。结果表明,过表达mi R-17-92基因簇能显著抑制TP53INP1的3'UTR报告基因活性;而转染mi R-20a抑制剂能显著提高TP53INP1的3'UTR报告基因活性。将mi RNA抑制剂分别转染到DF1细胞和鸡前脂肪细胞中,采用real-time RT-PCR方法检测细胞TP53INP1基因表达变化。结果显示,mi R-20a抑制剂能促进TP53INP1表达,TP53INP1是mi R-20a的一个靶基因。

草鱼TP53INP1基因的克隆及微囊藻毒素对其表达的影响

为深入研究肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)的结构及其在微囊藻毒素-LR(MC-LR)胁迫下的表达变化,以MC-LR诱导的草鱼(Ctenopharygodon idella)肝脏转录组测序获得的unigenes序列为基础,扩增获得了TP53INP1基因的cDNA序列(GenBank登录号:MG797689),其中开放阅读框(Open reading frame,ORF)为759 bp,编码252个氨基酸,属于β类型,具有4个PEST结构。氨基酸同源性分析结果表明,TP53INP1具有较高的保守性,其中与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)相似性最高。系统进化分析结果表明其与鱇浪白鱼(Anabarilius grahami)、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。采用荧光定量PCR分析发现TP53INP1基因在草鱼各组织中广泛分布,其中,在肝脏和血液等组织中表达丰富,显著高于在头肾组织中的表达(P<0.05)。采用Western blot检测分析不同剂量(25、75和100μg MC-LR/kg BW)MC-LR染毒96h后对草鱼肝脏TP53INP1蛋白的影响,结果发现草鱼在100μg MC-LR/kg BW剂量组中染毒96h后表达显著下降(P<0.05),暗示TP53INP1可能在响应MC-LR胁迫中起着重要作用。研究为进一步了解TP53INP1的功能及为深入探讨TP53INP1在鱼类响应MC-LR胁迫后的作用机制提供了基础资料。

ERBB4通过靶向调控miR-193a-3p调节TP53INP1的表达

目的:探究表皮生长因子受体4(ERBB4)与TP53诱导核蛋白1(TP53INP1)在肺腺癌中的表达作用关系,并揭示ERBB4的表达对肺腺癌预后的影响。方法:通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肺腺癌组织和细胞中ERBB4和TP53INP1的mRNA表达;通过Western印迹检测ERBB4和TP53INP1的蛋白表达;通过萤光素酶报告基因检测验证ERBB4和TP53INP1均是miR-193a-3p的靶基因;通过Kaplan-Meier Plotter分析平台分别检测TP53INP1和ERBB4基因在肺腺癌中的总生存期。结果:ERBB4和TP53INP1在肺腺癌组织和细胞中的mRNA表达分别显著低于癌旁组织和正常肺上皮细胞,P值均<0.05;ERBB4和TP53INP1表达越高,肺腺癌患者的整体生存期(OS)就越长;ERBB4和TP53INP1的mRNA表达显著正相关;转染ERBB4 siRNA后,转染组(si-ERBB4)ERBB4、TP53INP1蛋白表达均明显降低,P值均<0.05;ERBB4过表达(oe-ERBB4)使ERBB4、TP53INP1蛋白表达均明显增加,P值均<0.05;经萤光素酶报告基因检测验证,ERBB4和TP53INP1均是miR-193a-3p的靶基因;ERBB4通过靶向调控miR-193a-3p来调节TP53INP1的表达。结论:ERBB4和TP53INP1在肺腺癌组织或细胞中均低表达,两基因表达呈正相关,ERBB4可以通过靶向调控miR-193a-3p来调节TP53INP1的表达,且ERBB4和TP53INP1表达越高,肺腺癌的预后效果就越好。ERBB4或TP53INP1表达可以作为肺腺癌患者预后指标。

HIF-1α通过下调TP53INP1促进乳腺癌细胞的迁移及侵袭

目的:探讨HIF-1α通过调节TP53INP1蛋白对乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:通过免疫组化检测60例乳腺癌标本中TP53INP1和HIF-1α的表达情况及分析其临床病理资料。通过体外构建HIF-1α及共转染HIF-1α和TP53INP1细胞模型,迁移侵袭实验和划痕实验检测HIF-1α和TP53INP1对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响;Western blot实验研究共同下调HIF-1α和TP53INP1对MMP2、VEGF蛋白表达水平的影响。结果:免疫组化实验显示HIF-1α在人乳腺癌组织中高表达,TP53INP1呈低表达,两者之间具有相关性且均与淋巴结转移有关(P<0.05)。迁移侵袭实验及划痕实验显示在乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中下调HIF-1α抑制了迁移侵袭及愈合能力,MCF-7细胞中共同转染下调HIF-1α和TP53INP1质粒之后逆转了乳腺癌细胞的迁移侵袭能力及愈合能力(P<0.05)。Western blot实验显示shHIF-1α和TP53INP1共转染后在MDA-MB-231细胞中MMP2表达水平高于下调HIF-1α表达组。共转染shHIF-1α和shTP53INP1质粒后在MCF-7细胞中,VEGF和MMP2表达高于下调shHIF-1α组(P<0.05)。结论:HIF-1α可能通过下调TP53INP1的表达促进乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。

下调miR-19b靶向TP53INP1对骨肉瘤细胞侵袭迁移和凋亡的影响

目的研究miR-19b靶向调控TP53INP1对骨肉瘤细胞侵袭迁移和凋亡的影响。方法将骨肉瘤MG63细胞分为:对照组、抑制物阴性对照组(转染抑制物阴性对照)、miR-19b抑制物组(转染miR-19b抑制物)、siRNA阴性对照+miR-19b抑制物组(转染siRNA阴性对照和miR-19b抑制物)、TP53INP1 siRNA+miR-19b抑制物组(转染TP53INP1 siRNA和miR-19b抑制物)、模拟物阴性对照组(转染模拟物阴性对照)、miR-19b模拟物组(转染miR-19b模拟物)。以qRT-PCR测定转染效果,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移,流式细胞术测定细胞凋亡。靶基因预测软件预测TP53INP1为miR-19b的靶基因,双荧光素酶报告载体鉴定靶向关系。以Western blot测定上调或下调miR-19b对TP53INP1表达的影响。以miR-19b抑制物和TP53INP1 siRNA共转染至MG63细胞中,以流式细胞术和Transwell小室测定细胞凋亡和侵袭迁移变化。结果 miR-19b抑制物MG63细胞中miR-19b表达水平下降,侵袭和迁移能力下降,细胞凋亡率升高,与对照组、抑制物阴性对照组比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。miR-19b与TP53INP1mRNA的3,UTR有结合位点,荧光素酶报告载体鉴定TP53INP1为miR-19b的靶基因。与抑制物阴性对照组比较,miR-19b抑制物组上调细胞中TP53INP1蛋白表达水平,与模拟物阴性对照组比较,miR-19b模拟物组下调细胞中蛋白表达水平。与siRNA阴性对照+miR-19b抑制物组比较,TP53INP1 siRNA+miR-19b抑制物组能够上调MG63细胞的侵袭和迁移能力并减少细胞凋亡(P <0. 05)。结论下调miR-19b通过靶向调控TP53INP1可抑制骨肉瘤细胞侵袭迁移并诱导细胞凋亡。

miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响

目的探讨miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响。方法采用LipofectamineTM2000将miRNA-155 mimics(或带荧光无关序列阴性对照FAM-NC)转染雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性人乳腺癌MCF-7细胞,并设空白对照组;RT-PCR法检测转染后miRNA-155的表达水平;CCK-8法检测miRNA-155对MCF-7细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率和增殖周期;Western blot法检测TP53INP1、Caspase-3及p21蛋白的表达水平。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组miRNA-155的表达量明显增高;随着时间的延长,MCF-7细胞增殖活力逐渐增加;G1期细胞明显减少,S和G2期细胞增多,凋亡率明显降低;TP53INP1、Caspase-3激活型及p21蛋白的表达水平均明显降低。结论 miRNA-155能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1蛋白的表达,进而抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖,在乳腺癌发生发展中具有重要作用。

TP53INP1高表达在砷剂杀伤肺腺癌细胞中的增敏作用

目的构建TP53INP1高表达的肺腺癌A549细胞,初步研究提高TP53INP1的表达能否提高砷剂对肺腺癌细胞的杀伤作用。方法构建TP53INP1重组真核表达质粒,以慢病毒为载体将其转染到A549细胞,建立稳定高表达TP53INP1基因的A549-TP53INP1细胞株,以流式细胞术和MTT实验检测As_2O_3处理后A549-TP53INP1细胞的凋亡和存活率。结果成功构建稳定A549-TP53INP1细胞株。流式细胞术结果显示,相同剂量As2O3作用下(5~40μmol/L),A549-TP53INP1细胞凋亡率[(15.6±3.5)%]显著高于A549细胞[(10.0±2.5)%](P<0.05)。MTT实验显示,As_2O_3处理后A549-TP53INP1细胞的IC50值[(44.64±6.84)μmol/L]显著低于A549细胞[(54.25±6.13)μmol/L](P<0.05)。结论 TP53INP1高表达可增加砷剂对肺腺癌细胞的杀灭作用,提示TP53INP1可作为砷剂治疗肺癌的增敏靶点。

miR-155-TP53INP1调节轴在结直肠癌化疗药物敏感性中的作用机制

目的:初步揭示miR-155通过靶向调节TP53INP1表达水平影响结直肠癌细胞对5-FU化疗敏感性。方法:将人结肠直肠癌细胞系HCT116进行培养,提取细胞总RNA后,采用miR-155逆转录特异性引物构建反转录体系进行PCR扩增,通过qRT-PCR检测miR-155在5-FU耐药细胞HCT116/FU及敏感细胞株HCT116中的表达情况;取对数生长期细胞,分别转染miR-155mim-ics、miR-155抑制剂、miR-155阴性对照后,采用CCK-8法检测miR-155对细胞5-FU药物敏感性的影响,双荧光素酶报告基因系统验证miR-155与TP53INP1的靶基因关系,Western blot检测miR-155对TP53INP1表达的影响。结果:miR-155在HCT116/Fu细胞中的表达量是HCT116细胞的7.25倍;在相同5-FU浓度时,HCT116+阴性对照的细胞生长抑制率均高于HCT116+mimics、半数抑制浓度显著低于HCT116+mimics,差异均具有统计学意义(P<0.05);TP53INP1是miR-155的靶基因,能显著降低野生型TP53INP13'-UTR的荧光素酶活性;转染miR-155 mimics后,TP53INP1的相对表达量显著下降,转染miR-155抑制剂后,TP53INP1的相对表达量显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-155水平升高使HCT116细胞对5-FU的敏感性降低,miR-155可能通过靶向调节TP53INP1的表达水平,从而影响结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。

MicroRNA-10b调控乳腺癌细胞生长增殖与凋亡的研究

研究MicroRNA-10b(miR-10b)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的生长增殖和凋亡的调控作用。采用能模拟内源miR-10b的miR-10b模拟物以及能特异靶向敲除内源miR-10b的miR-10b抑制剂分别转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。RT-PCR测定转染后细胞中miR-10b的表达水平,MTT检测miR-10b对细胞增殖活力的影响,流式细胞仪检测miR-10b对细胞周期和凋亡的影响。生物信息学软件预测miR-10b潜在的靶基因,3'UTR荧光素酶报告法验证其靶向性,Western blot检测caspase-3、P21的蛋白表达水平。研究证实,miR-10b模拟物上调乳腺癌中miR-10b的表达水平,与对照组相比,细胞增殖能力提高,细胞周期加速,细胞凋亡率降低;反之miR-10b抑制剂能显著下调miR-10b的表达,与对照组相比,细胞增殖能力降低,细胞周期阻滞,细胞凋亡率上调。初步探讨miR-10b的作用机制可能是通过靶向作用于TP53INP1,抑制细胞周期与凋亡关键蛋白caspase-3、P21的表达水平,从而促进乳腺癌的发生发展。

TIGAR通过SIRT1-PGC1α途径抑制缺血低氧再灌注神经元细胞凋亡

目的探究TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)对缺血性脑卒中的作用及其可能的作用机制。方法神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(rat adrenal pheochromocytoma cell,PC12)神经元分化,氧糖剥夺再灌注(oxygen and glucose deprivation and reperfusion,OG D/R)建立缺血性脑卒中体外模型。免疫荧光染色检测PC12细胞神经元分化潜能;CCK-8检测细胞活力;RT-PCR检测TIGAR mRNA表达;Western blot检测TIGAR蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果NGF诱导后PC12细胞中神经元特异性标志物NSE呈阳性表达。与siRNA阴性对照(siRNA negative control,si-NC)组相比,TIGAR特异性siRNA序列(TIGAR specific siRNA sequence,si-TIGAR)组细胞中TIGAR mRNA表达、TIGAR、SIRT1和PGC1α蛋白表达量和细胞活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与NC组相比,TIGAR组细胞中TIGAR、SIRT1和PGC1α蛋白表达量和细胞活力显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与TIGAR组相比,TIGAR+EX 527组细胞中SIRT1和PGC1α蛋白表达及细胞活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),TIGAR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论TIGAR通过激活SIRT1-PGC1α途径在OGD/R神经元细胞中发挥保护作用。

姜黄素通过下调microRNA-211表达促进结肠癌细胞的凋亡及其机制

目的 检测姜黄素对结肠癌细胞中微小RNA 211（microRNA 211，miR-211）表达的影响并探讨miR-211调控结肠癌细胞增殖和凋亡的可能机制。方法 使用MTT法和流式细胞术检测不同浓度姜黄素在不同时间点对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响；使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同浓度姜黄素对结肠癌细胞中miR-211表达的影响；使用生物信息学预测miR-211下游靶基因TP53INP1并使用荧光素酶报告基因法验证其结合；用miR-211模拟物（miR-211 mimics）检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖的影响，同时使用Western blot法检测其对TP53INP1蛋白表达的影响；用TP53INP1小干扰RNA检测其对姜黄素处理的结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。结果 相较于未处理组，姜黄素在10～50 μmol/L浓度可抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡（P 〈0.05）。姜黄素可抑制肿瘤细胞中miR-211的表达，并具有时间和剂量依赖性（P 〈0.05）；此外，miR-211下游靶基因TP53INP1蛋白表达量上调（P 〈0.05）。用miR-211转染结肠癌细胞可逆转姜黄素对其增殖的抑制作用，并且TP53INP1表达下调（P 〈0.05）；用TP53INP1小干扰RNA可逆转姜黄素对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响（P 〈0.05）。结论 姜黄素可通过下调miR-211抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡，并且TP53INP1是miR-211下游调控蛋白之一。

miR-204对年龄相关性白内障LECs的抗氧化损伤作用及其机制

背景miRNAs是一类非编码的小分子RNA，对LECs的凋亡发挥调控作用，但miRNAs对年龄相关性白内障患者LECs中氧化损伤的生物学效应及其机制仍需进一步研究。目的探讨miR-204在体内及体外对年龄相关性白内障氧化损伤的作用及其机制。方法收集20例年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜和20个正常供体眼晶状体前囊膜，采用实时荧光定量PCR法检测2个组晶状体前囊膜中miR-204的表达量。对人晶状体上皮细胞系HLE—B3进行培养，在细胞培养液中添加200μmol／LH2O2建立LECs氧化损伤模型，然后将细胞分为模型对照组、miR-204拟似物组、拟似物对照组、miR-204拮抗物组、拮抗物对照组，分别在细胞培养液中添加相应的转染剂，未用H2O2处理的LECs作为正常对照组。转染后24h采用实时定量PCR法测定各组LECs中miR-204mRNA的表达以验证转染率；采用流式细胞仪测定体外各组细胞的凋亡率；采用实时荧光定量PCR和Westernblot法检测LECs中TP53INPl及p53mRNA和蛋白的相对表达量。结果年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中miR-204mRNA相对表达量明显低于正常人，差异有统计学意义（t=14．21，P〈0．05）。正常对照组、模型对照组、miR-204拟似物组、拟似物对照组、miR-204拮抗物组、拮抗物对照组细胞凋亡率分别为1．31±O．12、4．90±0．28、2．60±0．15、4．39±0．20、5．74±0．13和4．34±0．63，模型对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组，差异有统计学意义（t=-20．69，P〈0．01）；miR-204拟似物组细胞凋亡率明显低于拟似物对照组，而miR-204拮抗物组细胞凋亡率明显高于拮抗物对照组，差异均有统计学意义（t=-12．20，P〈0．01；t=3．79，P〈0．05）。实时荧光定量PCR和Westernblot法检测结果显示，模型对照组细胞中TP53INP1、p53mRNA及蛋白的相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（mRNA相对表达量：t=6．44、11．71，均P〈0．01；蛋白相对表达量：t=10．72、t=19．40，均P〈0．01）；miR-204拟似物组细胞中TP53INP1、p53mRNA和蛋白的相对表达量低于拟似物对照组，差异均有统计学意义（mRNA相对表达量：t=-19．28、-10．58，均P〈0．01；蛋白相对表达量：t=-6．50、-6．36，均P〈0．05）；miR-204拮抗物组TP53INP1、p53mRNA的相对表达量高于拮抗物对照组，差异均有统计学意义（mRNA相对表达量：t=4．07、3．74，均P〈0．05；蛋白相对表达量：t=7．18、10．58，均P〈0．05）。结论MiR-204通过下调靶基因TP531NP1在LECs中的表达抑制LECs的凋亡，从而对年龄相关性白内障LECs发挥抗氧化损伤作用，该作用可能是通过影响TP53INPl-p53通路实现的。

miRNAs对白内障患者晶状体上皮细胞中氧化损伤的生物学效应及其机制

目的探讨miR-204对年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)中氧化损伤的生物学效应及其机制。方法选取30例皮质性年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜和30例正常供体眼球晶状体前囊,采用实时荧光定量PCR检测其中miR-204的相对表达量。对LECs系HLE-B3进行培养,在对数期细胞培养液中加入终浓度200μmol/L的过氧化氢建立LECs氧化损伤模型,之后分为模型对照组、miR-204拟似物组、miR-204拮抗物组、拟似物对照组、拮抗物对照组,分别向细胞培养液中加入相应转染剂,未用过氧化氢处理的LECs为正常对照组。采用实时荧光定量PCR检测各组LECs中miR-204的表达量以验证转染率;流式细胞仪测定各组细胞凋亡率;实时荧光定量PCR和Western印迹法检测LECs中TP53INP1 mRNA和p53 mRNA和蛋白的表达量。结果 miR-204 mRNA在年龄相关性白内障患者晶状体组织中的表达量明显低于正常人(P<0.05)。细胞转染后各组间miR-204 mRNA表达量差异均显著(P<0.05),其中miR-204拟似物组明显高于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显低于拮抗物对照组(P<0.01)。模型对照组细胞凋亡率明显高于正常对照组,miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显高于拮抗物对照组(P<0.05),但拟似物对照组和拮抗物对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。模型对照组TP53INP1和p53 mRNA及蛋白的表达量明显高于正常对照组;miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组,miR-204拮抗物组明显高于拮抗物对照组(P<0.01,P<0.05)。结论 miR-204可通过下调TP53INP1基因在LECs中的表达来抑制LECs凋亡,发挥抗年龄相关性白内障患者氧化损伤的作用,该作用通过影响TP53INP1-p53通路实现。