梅毒螺旋体抗原TpN17和TpN44.5表位的融合表达及其意义

目的 :克隆并融合表达梅毒螺旋体特异性抗原TpN1 7和TpN4 4 .5的一个表位并应用于临床检测梅毒感染。 方法 :从梅毒基因组扩增出TpN1 7的全长基因 ,在其 5′端用聚合酶链反应 (PCR)加入TpN 4 4 .5的一个表位DNA片断 ,插入pGEX4T 2表达载体中 ,以亲和层析法纯化重组融合蛋白。将重组融合蛋白作为抗原制备酶联免疫吸附试验检测试剂盒 ,对正常人群、梅毒患者血清进行检测。 结果 :纯化后获得了相对分子质量为 4 5 0 0 0的特异性抗原。ELISA检测结果表明 :梅毒患者血清结果均阳性 ,正常人群血清均阴性。 结论 :本研究获得的TpN1 7和TpN4 4 .5融合抗原具有更好的灵敏度和特异性 ,为临床检测梅毒感染提供了新思路。

TpN17重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN17重组抗原,并建立操作简便、特异性好、敏感性高的梅毒血清抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN17基因,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白包被于反应板,建立检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法,利用该法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测血清样品,对其结果进行比较研究。结果TpN17重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法及试剂。对135例梅毒可疑患者血清进行检测,ELISA、TPHA和TRUST的检出阳性率分别为82.96%、98.52%和71.11%,而TRUST测出的8例可疑样品及31例阴性样品中,TPHA结果全部阳性、而ELISA只有2例阴性。结论TpN17重组抗原ELISA试剂在特异性和敏感性上明显优于TRUST法。

梅毒螺旋体TpN17抗原的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达梅毒螺旋体Tp N17抗原,通过亲和层析方法进行纯化,获得纯度较高的Tp N17抗原,利用该抗原建立梅毒诊断血清学方法。方法:将化学合成的Tp N17基因序列,克隆到p ET 22b质粒并转化到大肠杆菌BL21菌株中进行IPTG的诱导表达。利用Ni2+亲和层析柱对表达抗原进行纯化。结果:对插入片段进行测序,证实该序列结果与合成序列一致,并在大肠杆菌中成功表达Tp N17抗原,通过亲和层析获得纯度较高的目的抗原。结论:本研究中构建的大肠杆菌重组表达载体可有效的表达Tp N17抗原,经纯化后的抗原,可有望进一步应用于梅毒感染的血清学检测试剂盒的研发。

免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用评估

目的通过对4种血清学梅毒实验方法比对,评估免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达在梅毒诊断中的应用。方法于2018年6月~2019年6月,收集河北燕达医院28 417例梅毒筛查样本,综合化学发光微粒子免疫(CMIA)检测结果 S/CO值、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)结果及快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)检测结果进行分组,确认实验以梅毒螺旋体抗体免疫印迹试验(TP-WB)平行测定3组标本。相关分析采用Pearson r距离法;数据分类可视化采用主成分分析法。采用Medcalc软件进行ROC曲线统计分析,计算曲线下面积,确定CMIA法对梅毒诊断效能最大时的S/CO最佳截断点;不同诊断方法计数资料的比较采用卡方检验。结果以TP-WB结果为参照,ROC曲线分析发现,当CMIA法S/CO截断值为6.79时,敏感度为79.41%,特异度为96.05%,此时曲线下面积最大为0.911,即6.79为CMIA法的最佳诊断截断值。TPN15,TPN17,TPN45及TPN47抗体表达水平与S/CO比值均呈正相关(P<0.05),相关系数r分别为0.87,0.81,0.87及0.76。当标本中免疫印迹法检测TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体均阳性且着色强度数值高反应性(50~170)时,四种检测方法阳性符合率、总符合率为100%,显示评价方法和比对方法具有高度一致性(P<0.01)。结论活动性梅毒患者TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达均阳性且着色强度高反应性,梅毒抗体单阳梅毒特异性抗体TPN17和TPN47抗体表达减少且抗体着色强度降低,阳性率显著减少(P<0.05)。梅毒抗体结果可疑患者中TPN15,TPN17,TPN45和TPN47抗体表达明显减少,梅毒血清CMIA法筛查S/CO在6.79以下时,建议进一步采用梅毒免疫印迹检测法进行确证。

一种荧光定量PCR方法检测血液标本中梅毒螺旋体的应用研究

目的建立基于TpN17基因检测血液中梅毒螺旋体的荧光定量PCR方法。方法根据梅毒螺旋体TpN17基因保守区域设计引物,构建质粒标准品pTpN17,优化定量PCR反应体系检测该体系的灵敏度和特异性;同时,采用该方法对梅毒确证阳性的血液样本进行检测。结果研究表明,基于TpN17基因的SYBR GREEN荧光定量PCR方法可以有效检测血液中10^6-10^1 copies/μL的梅毒螺旋体并通过熔解曲线判定结果的特异性。结论以TpN17基因为扩增目的基因的SYBR GREEN荧光定量PCR方法具有灵敏快速便宜的特点,适用于在血液检测梅毒螺旋体,能广泛应用于献血及血液样本检测等领域,提高我国的血液安全。