人宫颈癌Hela细胞TPX2基因沉默对放射敏感性的影响

目的观察TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性。方法将宫颈癌Hela细胞分为TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组,TPX2-siRNA组转染TPX2-siRNA,NC-siRNA组转染NC-siRNA即空载体siRNA,Control组仅加入转染试剂。采用实时荧光定量PCR、Western blot分别检测各组细胞中的TPX2 mRNA与蛋白。采用CCK8法检测不同剂量(0、2、4、6 Gy)X线照射后TPX2-siRNA组细胞的增殖抑制率。采用流式细胞术检测4 Gy X线照射前后TPX2-siRNA组细胞的凋亡率。结果与NC-siRNA组、Control组相比,TPX2-siRNA组细胞TPX2 mRNA、蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。TPX2-siRNA组细胞接受0、2、4、6 Gy X线照射后,细胞增殖抑制率分别为4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%,两两组间比较P均<0.05。TPX2-siRNA组细胞接受4 Gy X线照射前后细胞凋亡率分别为11.43%±0.03%、12.68%±0.03%,两者比较P<0.05。结论 TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性增加。

siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响

目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化;Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示,TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72h时表达量最低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.

慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及机制

目的:研究慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌He La细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及其机制。方法:构建4种靶向TPX2基因的慢病毒表达载体(LV-TPX2-sh RNA-1/2/3/4),同时构建阴性对照质粒,将5种质粒分别转染到293T细胞中制备慢病毒。慢病毒感染宫颈癌He La细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TPX2 m RNA和蛋白的沉默效果。选择沉默效果最佳的重组慢病毒进行后续功能实验。分别采用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞术检测各组细胞的增殖、迁移及细胞周期分布情况。Western blot检测TPX2-sh RNA转染前后Ki-67、cyclin B2、Aurora-A及P53的表达。结果:与对照组比较,构建的靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体均可持续稳定的抑制He La细胞TPX2基因的表达,尤其以LV-TPX2-sh RNA-1最为明显(P<0.01),故选择LV-TPX2-sh RNA-1进行后续实验。与对照组比较,沉默TPX2基因的表达能降低He La细胞增殖及迁移能力(P<0.05),使G2及S期细胞比例明显增加(P<0.05),且上调P53蛋白的表达水平,下调Ki-67、cyclin B2及Aurora-A蛋白的表达水平(P均<0.05)。结论:沉默TPX2基因蛋白表达能抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力,可能与其改变细胞周期分布及下调Ki-67、cyclin B2、AuroraA蛋白表达水平,上调P53蛋白表达水平有关。

肺癌组织中FHIT和TPX2基因的表达及临床意义的研究

目的探讨FHIT和TPX2基因在肺癌中的表达与临床病理因素的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测FHIT和TPX2基因在肺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达。结果FHIT基因的表达水平在肺癌组织中的水平比正常肺组织低,差异有统计学意义(P<0.05),失表达率达74.2%。TPX2基因的表达水平在肺癌组织中的水平比正常肺组织高,差异有统计学意义(P<0.05),高表达率达64.5%。FHIT的表达异常与吸烟存在相关(P<0.05),TPX2的表达异常与临床病理因素均无关,两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论FHIT基因的失表达和TPX2基因的过表达在肺癌的发生发展中起重要作用,吸烟可能导致FHIT基因表达下降诱发肺癌。

TPX2基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制研究

目的探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖凋亡的影响和机制。方法 RT-PCR及Western blotting检测胃癌组织及癌旁组织中TPX2 mRNA和蛋白表达;将NC-siRNA、TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3转染人胃癌SGC-7901细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blotting检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;CCK8实验检测人胃癌SGC-7901细胞转染12、24、48 h后细胞增殖情况;细胞转染48 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotting检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果胃癌组织中TPX2 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.01);NC-siRNA组TPX2蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);TPX2-siRNA1、TPX2-siRNA2、TPX2-siRNA3组的TPX2蛋白表达均显著低于对照组(P<0.01),TPX2-siRNA3组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;NC-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),TPX2-siRNA组在12、24、48 h后的细胞存活率均显著低于对照组,且随着时间延长细胞存活率降低(P<0.01);NC-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),TPX2-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达均显著高于对照组,PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组(P<0.01)。结论 TPX2在胃癌中高表达,沉默TPX2的表达能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和促进细胞凋亡,其机制可能与PT3K/AKT信号通路的调控有关。

TPX2基因在乳腺癌病理进展和放疗中作用机制研究

目的研究TPX22基因对乳腺癌病理进程和放疗的影响及作用机制。方法建立乳腺肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型,根据是否接受细胞放射干预分为干预组和未干预组,采用免疫组化法检测两组乳腺癌细胞裸鼠模型接受放疗干预前后TPX22基因蛋白表达水平,并检测TPX2相关靶基因(Bcl-2、Bax、p21及p53)在乳腺癌组织中的蛋白表达,分析TPX2与其相关靶基因蛋白的相关性。结果两组乳腺肿瘤裸鼠模型右腋下均有显著移植瘤生长,肿瘤组织与周围正常组织分解清晰,移植瘤组织内有大量肿瘤细胞弥漫性分布,肿瘤细胞形态不规则。干预组接受放疗后TPX2阳性率50%,对照组87.5%。TPX2与Bcl-2表达水平呈显著正相关性(RBcl-2=0.9688),与Bax、p21及p53呈显著负相关性(RBax=-0.9675、Rp21=-0.9563、RP53=-0.9742)。结论 TPX2在乳腺癌细胞中呈高表达,可能通过调控Bcl-2、Bax、p21及p53等相关靶基因表达水平,参与疾病进展,影响放疗效果,TPX2有望成为乳腺癌治疗的新靶点。

shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549紫杉醇敏感性的影响

目的观察靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)-短发夹状RNA(shRNA)对肺腺癌A549细胞TPX2基因以及紫杉醇敏感性的影响。方法将靶向TPX2基因的片段插入载体后构建重组质粒,经Lipofectamine 2000将其导入A549细胞,并进行筛选及克隆化培养。细胞分3组培养:(1)转染组;(2)阴性对照组;(3)空白对照组。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western Blot)分析转染前后TPX2基因的表达情况。MTT法检测转染干扰载体后A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性变化。RT-PCR检测肺耐药蛋白(LRP)及多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA表达水平的变化。结果与对照组相比,转染重组质粒后,TPX2基因的表达明显降低,MTT法显示转染TPX2-shRNA载体质粒的A549细胞对紫杉醇的敏感性明显增加;RT-PCR检测相关基因显示,LRP、MRP mRNA表达水平与空白对照组相比无明显改变(P>0.05)。结论 TPX2-shRNA干扰载体能有效抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达,并增强其对化疗药物的敏感性。

干扰Hela细胞TPX2基因对细胞活性及其放疗敏感性的影响研究

目的:分析干扰Hela细胞TPX2基因对细胞的活性及放疗敏感性的影响。方法:体外培养宫颈癌Hela细胞系,并将其分为干扰组、阴性对照组(NC组)、空白对照组(CON组)。干扰组接受TPX2-siRNA干扰质粒、NC组接受空载体转染,CON组以PBS代替质粒,采用RT-PCR实验验证干扰效率,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用Transwell小室检测侵袭能力,流式细胞仪检测细胞周期,克隆形成实验检测放疗敏感性。结果:与CON组相比,NC组细胞的TPX2 mRNA相对表达量、TPX2蛋白相对表达水平、细胞侵袭能力均无明显变化(P>0.05);与CON组及NC组相比,干扰组细胞的TPX2 mRNA相对表达量、TPX2蛋白相对表达水平、细胞侵袭能力均明显降低(P<0.05)。与CON组相比,NC组细胞的细胞活性在各个时间点差异均无统计学意义(P>0.05);与CON组及NC组相比,干扰组细胞在培养时间为48h、72h、96h时的细胞活性均明显降低(P<0.05)。与CON组相比,NC组的G0/G1期、G2/M期及S期的细胞周期占比无明显改变(P>0.05);与NC组相比,干扰组细胞的S及G2/M期细胞占比明显增多,而G0/G1期细胞占比明显减少(均P<0.05)。与CON组相比,干扰组细胞在放疗剂量为4Gy、6Gy、8Gy、10Gy的生存率降低(P均<0.05)。结论:干扰宫颈癌Hela细胞TPX2基因可有效干扰TPX2基因的表达,阻碍宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移等细胞活性。干扰TPX2基因可有效提高宫颈癌Hela细胞的放疗敏感性,改善宫颈癌放射治疗的疗效。

食管鳞癌组织中RHAMM和TPX2基因的表达及临床意义的研究

目的:探讨透明质酸介导的细胞游走受体(Receptor for hyaluronan-mediated motility,RHAMM)和Xklp2靶蛋白(Targetingprotein for Xklp2,TPX2)基因在食管鳞癌中的表达及其与临床病理因素的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应技术,检测40例食管鳞癌肿瘤组织、癌旁组织、相应食管正常黏膜组织中RHAMM和TPX2基因的表达。结果:RHAMM mRNA在食管鳞癌组织中的表达(65.0%)显著高于癌旁组织(37.5%)及正常黏膜组织(22.5%),且与是否发生淋巴结转移有关(P<0.01);TPX2 mRNA在食管鳞癌组织中的表达(75.0%)也显著高于癌旁组织(47.5%)及正常黏膜组织(40.0%),与是否发生淋巴结转移及分化程度有关(P<0.05);RHAMM mRNA及TPX2 mRNA在食管鳞癌组织中的阳性表达具有相关性(P<0.01,r=0.39)。结论:RHAMM及TPX2基因可能共同参与了食管鳞癌的发生、进展及转移。

TPX2基因在宫颈癌诊断与治疗的临床价值

目的:研究TPX2基因在宫颈癌诊断与治疗的临床价值。方法采用RT-PCR技术和免疫组织化学法检测正常宫颈组织、宫颈鳞癌组织、宫颈鳞癌 Siha 细胞系、宫颈腺癌组织、宫颈腺癌 HeLa 细胞系和上皮内瘤变组织中TPX2基因的mRNA 和蛋白质。结果正常的宫颈组织TPX2mRNA表达量明显低于其他非正常组(P<0.05),TPX2蛋白很少出现在正常宫颈组织中,在宫颈鳞癌组织和上皮内瘤变组织中表达强度增加,TPX2蛋白表达强度与年龄关系不大,与病理级数和淋巴结转移有关。结论 TPX2基因可以作为宫颈癌诊断与治疗的一个指标,具有重要的临床价值。

人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选

目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株。方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒)。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因m RNA转录及蛋白的表达水平。结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功。经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株。与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因m RNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。

TPX2基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究

目的探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的影响及机制。方法 Western blot检测乳腺癌组织及癌旁组织中TPX2基因的表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA1和TPX2-siRNA2转染人乳腺癌MCF-7细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blot检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA转染细胞48 h后,CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Cleaved caspase3、p38、p-p38蛋白表达。结果 TPX2在乳腺癌组织的蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.01);TPX2-siRNA1组和TPX2-siRNA2组细胞中TPX2蛋白表达显著低于对照组(P<0.01),TPX2-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;siRNA-NC组的细胞存活率、细胞凋亡率及Cleaved caspase3、p-p38蛋白表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05),TPX2-siRNA组细胞存活率及p-p38蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P<0.01),p38蛋白表达在三个组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TPX2基因在乳腺癌组织中高表达,抑制TPX2的表达可降低细胞增殖及促进细胞凋亡,其机制与p38MAPK信号通路有关。

TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的探讨TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法构建3个靶向TPX2基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,转染A549细胞,RT-PCR检测TPX2基因mRNA的转录水平;筛选干扰效果最佳的质粒转染的细胞,RT-PCR检测增殖相关基因CDK4和CyclingD1 mRNA的转录水平,Western blot检测TPX2蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活力。结果 TPX2 shRNA-3质粒干扰效果最佳,有效沉默TPX2基因后,A549细胞中TPX2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均受到明显抑制(P<0.01),与空白对照组比较,抑制率分别为73.8%和82.8%;CDK4和CyclingD1基因mRNA的转录水平也明显降低(P<0.01或<0.05),与空白对照组比较,抑制率分别为76.7%和67.3%;A549细胞的生长和增殖也明显受到抑制,转染后72 h,增殖抑制率可达61.55%(P<0.05)。结论成功构建了靶向TPX2基因的shRNA表达质粒,其在mRNA和蛋白水平有效抑制A549细胞TPX2基因的表达后,细胞生长受到抑制,增殖能力减弱。

短发夹RNA靶向沉默TPX2基因促进人肺腺癌A549细胞凋亡及其相关机制

目的:探讨靶向Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein2,TPX2)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能机制。方法:构建靶向TPX2基因的shRNA重组载体,将其转染至肺腺癌A549细胞中,RT-PCR检测细胞中TPX2、Aurora-A、p53和Bcl-2mRNA的表达,蛋白质印迹法检测TPX2蛋白的表达,FCM检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:成功构建重组载体pMagic4.1-shRNA-TPX2。将pMagic4.1-shRNA-TPX2转染至A549细胞后,TPX2、Aurora-A和Bcl-2mRNA的表达水平明显下调,p53mRNA的表达水平明显上调,TPX2蛋白的表达水平明显下调,细胞凋亡率明显增加,细胞阻滞于S期,与空白对照组(未转染组)和阴性对照组(转染pMagic4.1-shRNA-NC)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:靶向TPX2的shRNA能促进肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调p53表达和下调Bcl-2表达有关。

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。