基于TRAF1/ASK1/JNK通路研究黄精水提物对过食“辛辣醇酒”致胃黏膜损伤小鼠的保护作用

为探讨黄精水提物对胃阴亏虚型胃黏膜损伤小鼠的改善作用和潜在机制,采用ICR小鼠每天灌胃1次辛辣物酒混溶液连续6周,建立胃阴亏虚型胃黏膜损伤小鼠模型。造模成功后,将模型小鼠按体质量随机分为模型组、黄精水提物0.5 g·kg^(-1)组、黄精水提物1.0 g·kg^(-1)组。模型组和各给药组每天继续灌胃1次辛辣物酒混溶液,同时给药组按照剂量灌胃相应药物,连续7周。给药期间,检测各组小鼠胃阴亏虚证相关中医证候指标;末次给药后解剖取胃组织观察其组织形态学变化,检测胃组织匀浆中抗氧化酶活性,酶联免疫吸附测定法、免疫组化法检测胃组织中炎症因子的表达,Western blot法检测肿瘤坏死因子受体相关因子1(TNF receptor-associated factor 1,TRAF1)/凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)通路相关分子的蛋白表达,免疫荧光法检测凋亡因子的表达。结果显示,黄精水提物能有效改善小鼠的胃阴亏虚证;改善胃黏膜组织病变;提高胃组织中抗氧化酶活性(P<0.05,P<0.01);降低胃组织中促炎因子的水平(P<0.05,P<0.01);降低胃组织TRAF1/ASK1/JNK通路相关分子的蛋白表达(P<0.01);降低胃组织促细胞凋亡因子表达,提高B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达。以上提示,黄精水提物能缓解饥而不欲食、口干渴、大便干结等胃阴亏虚证证候,并能改善过食“辛辣醇酒”引起的胃黏膜损伤,其作用机制可能与抑制TRAF1/ASK1/JNK通路减少胃组织细胞凋亡和炎症有关。

酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路的影响

目的基于内质网应激(ERS)肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路探讨酸枣仁-合欢花对孤养结合慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠的干预作用。方法将144只大鼠随机分为正常组、模型组及酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组和文拉法辛组。除正常组外,其他各组进行21 d的孤养结合CUMS制备大鼠抑郁模型。用旷场实验和Morris水迷宫实验观察大鼠行为学变化;用透射电镜观察海马神经细胞超微结构变化;用TUNEL染色法观察海马神经细胞凋亡情况;用Western Blot法检测海马组织IRE1α、磷酸化(P)-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平;用Real-Time PCR法检测海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组旷场实验中水平运动和垂直运动得分下降(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少(P<0.01);海马神经细胞凋亡数增加(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平升高、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,酸枣仁-合欢花各组及文拉法辛组旷场实验中水平运动和垂直运动得分升高(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期缩短、跨越原平台次数增加(P<0.01);海马神经细胞凋亡数减少(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且酸枣仁-合欢花中剂量组较高、低剂量组效果更好。结论酸枣仁-合欢花可能通过调节内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路发挥抗抑郁作用。

基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用

目的 基于c-Jun氨基末端激酶(JNK)-p62/螯合体(SQSTM1)信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞的保护作用。方法 SD大鼠随机分成正常组、DN组、糖肾煎低、中、高[生药5、10、20 g/(kg·d)]剂量组(糖肾煎-L、M、H组)、二甲双胍组[100 mg/(kg·d)]。除正常组外,其余各组通过喂养高脂高糖饲料和腹腔注射链脲佐菌素(STZ)进行DN模型构建。药物干预结束后,检测大鼠血生化指标空腹血糖(FBG)、负荷后2 h血糖(P2 h BG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)、六胺银(PASM)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜(TEM)观察肾小球基底膜损伤和足细胞变化情况;Western印迹检测肾组织中微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、肾病蛋白(Nephrin)蛋白表达。结果 与正常组比较,DN组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显升高,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显降低(P<0.05);光镜下观察到肾小球缩小、管丛系膜明显扩张,并有基底膜增生增厚等现象;TEM下观察到肾小球基底膜增厚、足细胞排列紊乱、形态改变、足突融合等现象。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组和二甲双胍组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05);并且肾小球基底膜增厚、足细胞足突融合等情况均获得一定程度减轻。结论 糖肾煎对2型DN大鼠足细胞具有一定保护作用,可能是通过调控JNK-p62/SQSTM1信号通路,提高足细胞自噬,从而起到肾脏保护功效。

基于TRAF6/TAK1信号通路探讨清眩润目饮对干眼大鼠的作用机制

目的探究清眩润目饮通过TRAF6/TAK1信号通路对干眼模型大鼠的作用机制。方法将40只雌性大鼠分为空白组、模型组、清眩润目饮组、玻璃酸钠组,模型组、清眩润目饮组、玻璃酸钠组予0.2%BAC滴眼建立干眼模型。造模成功后,清眩润目饮组予中药灌胃+PBS缓冲液滴眼;玻璃酸钠组大鼠予等量生理盐水灌胃+玻璃酸钠滴眼液滴眼,连续2周。给药2周时进行泪液分泌检测(SIT)及角膜荧光素钠评分(FL),处死大鼠并留取角膜组织,采用ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及MMP9含量,HE染色观察角膜组织病理学变化;免疫组化染色观察TFAF6的蛋白表达,Western blotting检测TRAF6、p-TAK1及TAK1蛋白的表达量。结果与模型组相比,清眩润目饮组及玻璃酸钠组SIT显著增高(P<0.05),FL显著降低(P<0.05)。HE染色结果显示,清眩润目饮组及玻璃酸钠组角膜组织形态得到明显改善。免疫组化结果显示,清眩润目饮组及玻璃酸钠组TFAF6含量显著低于模型组(P<0.05)。Western blotting结果显示,与模型组相比,清眩润目饮组及玻璃酸钠组大鼠TRAF6水平降低(P<0.05),清眩润目饮组p-TAK1/TAK1水平显著降低(P<0.05)。ELISA结果显示,清眩润目饮组及玻璃酸钠组IL-1β、TNF-α及MMP9水平较模型组显著降低(P<0.05)。结论清眩润目饮能够改善干眼大鼠角膜组织损伤,抑制炎症反应的发生,从而缓解干眼大鼠眼部症状,其机制可能是通过抑制TRAF6/TAK1信号通路实现的。

解毒通利方对肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及ASK1/JNK通路的调节作用

目的研究解毒通利方对肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用及对凋亡信号调节激酶(ASK)1/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的调节作用。方法采用接种NCI-H358细胞法建立肺癌荷瘤小鼠模型,小鼠随机分为生理盐水组、解毒通利方低、中、高剂量组及顺铂组各6只,解毒通利方低、中、高剂量组分别按照10、20、40 g/kg(以生药含量计)灌胃给予小鼠解毒通利方,顺铂组按照5 mg/kg腹腔注射给予顺铂,生理盐水组灌胃给予生理盐水,1次/d,连续30 d,末次给药24 h后,分离肿瘤组织,测定肿瘤体积及重量,苏木素-伊红(HE)染色法检查肿瘤组织病理学,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色测定肿瘤组织细胞凋亡率,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及Western印迹测定肿瘤组织ASK1、JNK mRNA及蛋白水平,免疫组化法测定肿瘤组织ASK1及JNK的平均积分光密度(IOD)值。结果与生理盐水组比较,解毒通利方低、中、高剂量组及顺铂组肿瘤体积及重量显著降低,而肿瘤组织细胞凋亡率、肿瘤组织ASK1及JNK mRNA及蛋白水平、肿瘤组织ASK1及JNK免疫组化水平均显著升高(均P<0.05),小鼠肿瘤组织病理学改变明显。结论解毒通利方能够显著抑制肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长,促进肿瘤细胞凋亡,其机制可能与调节ASK1/JNK通路有关。

基于TRAF2/AP-1信号通路探讨柴苓合剂对痰瘀互结MS-IR大鼠炎症因子影响

目的基于TRAF2/AP-1信号通路探讨柴苓合剂对痰瘀互结代谢综合征胰岛素抵抗(MS-IR)大鼠糖代谢、脂代谢、炎症因子的部分作用机制。方法48只SPF级SD雄性大鼠随机分为空白组和造模组。造模组大鼠采用高脂高糖饲料喂养,注射小剂量链脲佐菌素(STZ)(35 mg/kg),同时用物理刺激方法,建立痰瘀互结型MSIR大鼠模型。造模成功后将大鼠随机分为模型组,柴苓合剂低、中、高剂量组,西药组进行干预。给药各组分别进行柴苓合剂、吡格列酮干预治疗3周,空白组、模型组给予等体积的蒸馏水灌服。生化检测大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;Western Blot检测肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达;HE染色切片,光学显微镜观察用药前后肝细胞损伤、肝细胞坏死、脂质堆积、炎症细胞浸润等情况。结果(1)糖代谢指标水平。与空白组相比,模型组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平均升高(P<0.01);与模型组相比,柴苓合剂低、中、高剂量组及西药组FBG、FINS、HOMA-IR水平均降低(P<0.01);与西药组比较,柴苓合剂高剂量组FBG、FINS、HOMA-IR水平差异无统计学意义(P>0.05);与柴苓合剂低剂量组比较,柴苓合剂高、中剂量组及西药组FBG、FINS、HOMA-IR水平均降低(P<0.01);与柴苓合剂中剂量组比较,柴苓合剂高剂量组及西药组FBG、FINS、HOMA-IR水平降低(P<0.01)。(2)脂代谢指标水平。与空白组相比,模型组大鼠甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)水平均升高(P<0.01);与模型组相比,柴苓合剂低、中、高剂量组及西药组TG、CHO水平均降低(P<0.01);与西药组相比,柴苓合剂中、高剂量组TG、CHO水平均降低(P<0.05,P<0.01),柴苓合剂低剂量组TG、CHO水平差异无统计学意义(P>0.05);与柴苓合剂低剂量组相比,柴苓合剂中、高剂量组TG、CHO水平均降低(P<0.01);与柴苓合剂中剂量组相比,柴苓合剂高剂量组TG、CHO水平均降低(P<0.01)。(3)TNF-α、IL-6水平。与空白组相比,模型组大鼠TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.01);与模型组相比,柴苓合剂低、中、高剂量组及西药组TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.01);与西药组相比,柴苓合剂低、中、高剂量组TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.01);与柴苓合剂低剂量组相比,柴苓合剂中、高剂量组TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05,P<0.01);与柴苓合剂中剂量组相比,柴苓合剂高剂量组TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.01)。(4)肝组织TRAF2/JNK/AP-1信号通路蛋白表达。与空白组相比,模型组大鼠肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达均上调(P<0.01);与模型组比较,柴苓合剂低、中、高剂量组及西药组肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达水平均降低(P<0.05,P<0.01);与西药组比较,柴苓合剂高剂量组肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达水平均降低(P<0.01),柴苓合剂低、中剂量组肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与柴苓合剂低剂量组比较,柴苓合剂高剂量组肝组织TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达水平均降低(P<0.01),柴苓合剂中剂量组肝组织AP-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),TRAF2、JNK蛋白表达水平均降低(P<0.01);与柴苓合剂中剂量组比较,柴苓合剂高剂量组TRAF2、JNK、AP-1蛋白表达水平均降低(P<0.05,P<0.01)。结论柴苓合剂高剂量能显著改善痰瘀互结MS-IR大鼠糖代谢、脂代谢和炎症因子,其作用机制可能是柴苓合剂通过调控TRAF2蛋白作用于JNK蛋白,引起它的下游反应,又通过JNK的磷酸化作用于AP-1,释放炎症因子,从而TRAF2作用于JNK,然后磷酸化于AP-1使炎症因子降低有关。

比索洛尔通过ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路改善缺血再灌注诱导的H9C2心肌细胞损伤的研究

目的:探讨比索洛尔对缺血再灌注(I/R)诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,将H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、缺氧/复氧(H/R)模型组(Model组)、比索洛尔组(Bisoprolol组)、比索洛尔+凋亡信号调节激酶1(ASK1)重组蛋白组(Bisoprolol+ASK1组)。除Control组外,其余各组H9C2心肌细胞均进行H/R损伤处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测细胞活力;采用流失细胞术检测细胞凋亡;采用酶联免疫吸附试验检测细胞中心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)]和炎症因子[白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;采用激光共聚焦检测细胞中钙离子浓度;采用蛋白质印迹法检测细胞中ASK1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,Model组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Bisoprolol组和Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均升高,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Bisoprolol组比较,Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:比索洛尔能够通过抑制炎症反应和钙超载,改善I/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其作用机制可能与抑制ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路激活有关。

转染DPP-4 siRNA或(和)加入SP600125的小鼠肺泡巨噬细胞极化及JNK/AP-1信号通路激活情况观察

目的观察转染二肽基肽酶-4(DPP-4)siRNA或(和)加入c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)的小鼠肺泡巨噬细胞极化情况、JNK/AP-1信号通路激活情况。方法体外培养小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S),并随机分组:Control组转染空载siRNA、siDPP-4组转染DPP-4 siRNA、LPS组转染空载siRNA+LPS、siDPP-4+LPS组转染DPP-4 siRNA+LPS、LPS+SP600125组转染空载siRNA+LPS联合SP600125、siDPP-4+LPS+SP600125组转染DPP-4 siRNA+LPS联合SP600125。采用Western boltting法检测巨噬细胞中M1型和M2型极化标志物CD86、CD206蛋白及JNK、激活蛋白-1(AP-1)转录蛋白(c-Jun、c-Fos)磷酸化,RT-qPCR法检测巨噬细胞中M1型标志物(CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β)和M2型标志物[CD206、精氨酸激酶-1(ARG-1)、IL-4、IL-10]mRNA,一氧化氮(NO)测定试剂盒、免疫荧光检测巨噬细胞上清液中M1型促炎因子NO和细胞内活性氧(ROS)生成情况。结果与Control组比较,LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量升高,P均<0.05。与siDPP-4+LPS组比较,siDPP-4+LPS+SP600125组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量降低,P均<0.05。结论转染DPP-4 siRNA可促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化,抑制肺泡巨噬细胞M2型极化,并增加JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达;加入JNK抑制剂后,可降低由转染DPP-4 siRNA引起的JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达升高。转染DPP-4 siRNA促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化的作用机制可能与激活JNK/AP-1信号通路有关。

刺甘草查尔酮下调ASK1-JNK信号通路抗FFA诱导的非酒精性脂肪性肝病

目的探究刺甘草查尔酮(echinatin,Ech)对游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)诱导人肝癌(HepG2)细胞的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型的影响及作用机制。方法实验分组为对照组、FFA模型组、Ech组(0.3、1、3μmol·L^(-1));通过细胞形态学和化学荧光法分析细胞内脂质积累、线粒体损伤、氧化应激以及凋亡情况;分子对接预测Ech与ASK1和JNK蛋白的亲和力;Western blot分析NF-κB p65、BAX以及ASK1-JNK信号通路相关蛋白表达情况。结果相较于FFA模型组,Ech组细胞脂质积累明显减轻,线粒体损伤以及氧化应激情况得到改善,凋亡率明显下降,并且NF-κB p65、BAX、p-ASK1、JNK、p-JNK的蛋白表达量均明显降低。结论Ech改善FFA诱导的HepG2细胞脂质积累、线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡以及炎症反应,可能与下调ASK1-JNK信号通路有关。

延龄草总皂苷通过调控GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路抑制内质网应激而减轻PSCI大鼠海马神经元损伤

目的:探讨延龄草总皂苷(TST)对卒中后认知障碍(PSCI)大鼠海马神经元的保护作用及分子机制。方法:将采用改良Zea Longa线栓法造模成功的大鼠随机分为模型(model)组、TST(100 mg/kg)组和盐酸多奈哌齐(DON;0.45 mg/kg)组,另设假手术(sham)组,每组10只,连续给药4周。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;TTC染色检测大鼠脑梗死体积变化,HE、Nissl和TUNEL染色观察大鼠海马组织神经元病理变化;免疫组化及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、胱天蛋白酶12(caspase-12)、Bax和Bcl-2的蛋白水平。结果:与sham组相比,model组大鼠逃避潜伏期显著延长,穿越平台次数及目标象限停留时间显著减少(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著增大,神经元尼氏小体数量显著减少,凋亡细胞显著增多;海马组织中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.01)。与model组比较,TST组及DON组大鼠逃避潜伏期显著缩短,穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著缩小,神经元尼氏小体数量显著增多,凋亡细胞显著减少;GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:TST对PSCI大鼠海马神经元具有保护作用,其机制可能与减轻内质网应激、减少神经元凋亡并抑制GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路有关。

扁蒴藤素调节ROS/ASK1/JNK信号通路对二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌的抑制作用

目的探讨扁蒴藤素(Pris)通过调节ROS/ASK1/JNK信号通路对二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝细胞癌(HCC)的影响。方法随机取6只SD大鼠作为对照组,其余大鼠采用注射DEN的方式构建HCC大鼠模型。将造模成功的大鼠随机平分为HCC组、Pris组(0.8 mg/kg Pris)、Vaccarin组(100 mg/kg ROS/ASK1/JNK信号通路抑制剂Vaccarin)、Pris+Vaccarin组(0.8 mg/kg Pris+100 mg/kg Vaccarin),连续注射1周,每组均6只大鼠。HCC组和对照组注射等量生理盐水。测量体质量、肝质量以及肝脏体质量比;ELISA法检测肝功能、炎性因子、抗氧化指标、ROS水平;HE染色检测肝脏病理变化;Western blot检测凋亡标志物(Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3)以及ROS/ASK1/JNK信号通路蛋白表达。结果对照组大鼠表现出正常的肝脏组织结构;HCC组可以观察到部分肝细胞坏死,出现局灶性结节性增生现象,HCC组较对照组体质量、Bax、cleaved-Caspase-3、ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著下降(P<0.05),肝脏质量、肝脏体质量比、ALT、AST、ALP、LDH含量、IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx、CAT含量、Bcl-2蛋白水平显著增加(P<0.05);Pris组改善了肝细胞坏死以及局灶性结节性增生现象,Pris组较HCC组体质量以及Bax、cleaved-Caspase-3、ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著升高(P<0.05),肝脏质量、肝脏体质量比、ALT、AST、ALP、LDH含量、IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx、CAT含量、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05),而Vaccarin组趋势相反;Vaccarin逆转了Pris对HCC大鼠的抗癌效果。结论Pris可能通过激活ROS/ASK1/JNK信号通路对HCC大鼠起到一定的抑癌作用。

天麻素经IRE1α/TRAF2/NF-κB通路调控大鼠急性心肌梗死诱导的炎性反应及机制研究

目的探讨天麻素对大鼠急性心肌梗死(AMI)诱导的炎性反应的影响,并分析其作用机制。方法50只SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(AMI)组、天麻素低剂量(L-GAD)组、天麻素高剂量(H-GAD)组、卡托普利(CAP)组,每组10只。采用超声心动图检测大鼠心功能,TTC染色评估大鼠心肌梗死面积比,HE染色观察大鼠心肌组织病理形态学变化,ELISA法和qRT-PCR法分别检测大鼠血清及心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量及mRNA表达,Western blot法检测大鼠心肌组织中肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)/核因子(NF)-κB通路蛋白表达。结果与Sham组比较,AMI组大鼠心肌组织受损,存在明显心肌梗死,LVEF降低,LVDs和LVDd升高,血清和心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1水平及mRNA表达升高,心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织损伤减轻,心肌梗死面积比减小,LVEF升高,LVDs和LVDd降低,血清和心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1水平及mRNA表达降低,心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论天麻素可通过调控IRE1α/TRAF2/NF-κB通路减轻AMI大鼠心肌组织损伤及心肌梗死面积,改善大鼠心功能,抑制炎性反应。

针刺对SHR颈内动脉顺应性及JNK/MCP1通路的影响

目的研究针刺“降压方”对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rats,SHR)颈内动脉顺应性的影响及血管保护机制。方法选用11周龄雄性SHR大鼠30只,随机分为模型组、针刺组,另取Wistar Kyoto Rats(WKR)大鼠15只为正常对照组。模型组、对照组采用与针刺组相同的抓取固定,针刺组另予腧穴“降压方”针刺,每日1次。干预4周后,离体组织恒温灌流及生物机能实验系统检测各组大鼠颈内动脉收缩和舒张反应性,电镜观察颈内动脉内膜及中膜超微结构,ELISA检测血清c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP1)水平,免疫荧光双染观测颈内动脉p-JNK/MCP1表达,Western blot检测颈内动脉转录因子AP1(activator protein-1,AP1)、细胞表面趋化因子受体-2(CC chemokine receptor 2,CCR2)蛋白表达。结果针刺能降低SHR颈内动脉对去甲肾上腺素的缩血管敏感性,增强其对硝普钠的舒张血管反应。针刺能减轻SHR颈内动脉内膜及中膜损伤,降低血清JNK、MCP1水平(P<0.05),减少颈内动脉p-JNK/MCP1荧光强度及AP1、CCR2蛋白表达(P<0.05)。结论针刺能抑制颈内动脉JNK/MCP1通路,发挥良性调节SHR颈内动脉舒缩反应性及减轻颈内动脉损伤的作用。

苏木乙酸乙酯提取液对动脉粥样硬化小鼠ASK1-JNK信号通路及胶原蛋白水平的影响

目的观察苏木乙酸乙酯提取液(SAEE)对动脉粥样硬化模型小鼠ASK1-JNK信号通路及胶原蛋白表达的影响。方法 50只10周龄雄性载脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠随机分为空白对照组、模型组、SAEE低剂量组、SAEE中剂量组和SAEE高剂量组。除空白对照组,其他组小鼠均采用高脂饮食喂养的方式造模。造模后药物组给予相应剂量的SAEE灌胃治疗,空白对照组、模型组给予等容积的蒸馏水灌胃。实验结束后收集标本,ELISA法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TAG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,Western blotting和RT-PCR法检测TNF-α、p-ASK1、ASK1、pJNK、JNK、脯氨酰-4-羟化酶(P4H)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)及Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)蛋白及m RNA的表达。结果与空白组比较,模型组小鼠TC、TAG、LDL、TNF-α、p-ASK1、p-JNK的水平显著升高,HDL、P4H、COL-I、COL-Ⅲ的水平和COL-I/COL-Ⅲ的比值显著降低,差异均具有统计学意义(P <0.01)。与模型组比较,SAEE能显著抑制小鼠TC、TAG、LDL、TNF-α、p-ASK1、p-JNK的水平,升高HDL、P4H、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值,差异均具有统计学意义(P <0.01);在SAEE各剂量组中,以SAEE高剂量组疗效最佳。结论SAEE能够通过抑制炎症反应和ASK1-JNK信号通路的活化,达到调控血脂和稳定斑块的目的。

汉黄芩素通过调控JNK/AP-1信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经功能障碍、脑组织损伤的影响

目的探讨汉黄芩素通过调控c-Jun氨基末端激酶(JNK)/激活蛋白-1(AP-1)信号通路对缺血性脑卒中(CIS)大鼠神经功能障碍及脑组织损伤的影响。方法大鼠随机分为对照组、模型组、汉黄芩素低剂量组(0.07 mg/kg)、汉黄芩素高剂量组(0.14 mg/kg)、丁苯酞组(20 mg/kg)、汉黄芩素高剂量+JNK激活剂(Anisomycin)组(0.14 mg/kg+5 mg/kg),每组20只。对照组大鼠仅切开皮肤、分离血管,不进行拴线处理,其余各组均按照改良的线栓法构建CIS模型。建模成功后,各组给予相应剂量药物,每天1次,连续14 d。Zea-Longa评分法评价大鼠神经功能,TTC染色测定大鼠脑梗死体积,干湿重法测定大鼠脑组织含水量,HE染色观察大鼠脑组织海马CA1区神经细胞病理变化,试剂盒检测大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平,TUNEL染色检测大鼠脑组织神经细胞凋亡,Western blot法检测大鼠脑组织p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠海马CA1区神经细胞病理损伤严重,神经功能评分、脑梗死体积百分比、脑组织含水量、MDA水平、神经细胞凋亡率、p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表达升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);与模型组比较,汉黄芩素各剂量组和丁苯酞组以上指标改善(P<0.05);Anisomycin减弱了高剂量汉黄芩素对CIS大鼠神经功能障碍及脑组织损伤的改善作用。结论汉黄芩素可能通过抑制JNK/AP-1信号通路来改善CIS大鼠神经功能障碍及脑组织损伤。

基于Trx2/ASK1信号通路探讨补骨颗粒对软骨细胞凋亡的调控机制

目的:观察补骨颗粒对软骨细胞凋亡及对Trx2/ASK1/Caspase-3表达的影响,从而探讨补骨颗粒对软骨细胞凋亡影响机制,为进一步研究补骨颗粒防治骨关节炎奠定实验基础。方法:将20只SD大鼠随机分为空白对照组,补骨颗粒低、中、高剂量组,每组5只。适应性喂养7 d,空白对照组给予蒸馏水2 m L·kg^(-1)灌胃,补骨颗粒低、中、高剂量组给予补骨颗粒1.54 g·kg^(-1)、3.08 g·kg^(-1)、6.16 g·kg^(-1)灌胃。干预14 d后,抽取血液经离心获得血清。通过酶联免疫吸附试验检测血清中Trx2、ASK1、Caspase-3表达量,采用MTT法检测血清干预后的细胞增殖活性,采用流式细胞仪检测血清干预后的软骨细胞凋亡率。结果:与空白对照组比较,补骨颗粒低、中、高剂量组Trx2、ASK1与Caspase-3含量明显减少,差异均有统计学意义(P <0.05);与补骨颗粒中剂量组比较,补骨颗粒低剂量组和高剂量组Trx2与ASK1含量明显增多,补骨颗粒低剂量组Caspase-3含量明显增多,差异均有统计学意义(P <0.05)。与空白对照组比较,补骨颗粒低、中、高剂量组OD值明显升高(P <0.05);补骨颗粒低、中、高剂量组组间比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。流式细胞仪检测发现,不加入硝普钠时(对照组1)软骨细胞的凋亡率最低为4.25%,加入硝普钠后(空白对照组1)软骨细胞的凋亡率变为46.86%,补骨颗粒低剂量组1软骨细胞的凋亡率(30.15%)高于补骨颗粒中剂量组1(27.77%)和高剂量组1(27.41%)。结论:补骨颗粒将会调控Trx2表达,并且不同剂量补骨颗粒将会通过Trx2-ASK1解离度调控Caspase-3活化程度而影响软骨细胞的凋亡,这将有助于进一步认识补骨颗粒对骨关节炎防治过程。

DLEU1通过调控p38/JNK信号通路促进高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖和血管重塑的实验研究

目的:探讨淋巴细胞白血病缺失基因1(DLEU1)促进高血压大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和血管重塑的机制及相关信号通路。方法:将12只DLEU1转基因大鼠(DTRs)随机分为DTRs组、p38组、JNK组,每组4只,分别经腹腔注射二甲基亚砜溶液、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125,并以Wistar大鼠(4只)为对照组,采用苏木精-伊红(HE)染色确定主动脉、心脏和肾脏的形态结构。通过转染DLEU1过表达质粒,构建DLEU1过表达的VSMCs,同时给予SB203580、SP600125干预,通过溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)实验、细胞周期及迁移实验比较不同干预细胞的生物活性的差异。结果:DTR组大鼠血管腔面积显著减小、中膜增厚,肾组织中可见小动脉增生,血管壁和肾小球增厚,p38及JNK抑制剂可减轻DLEU1介导的血管中膜增厚的效应,增加中膜/管腔面积比,肾脏小动脉的病理改变也有所改善。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测显示,转染过表达DLEU1质粒后,VSMCs中DLEU1的相对表达量显著提高(P<0.05),表明细胞模型构建成功。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测发现,磷酸化p38和JNK蛋白的表达上调。DLEU1过表达导致细胞增殖率显著增加。经p38和JNK抑制剂处理后,细胞增殖率均有所下降(P<0.05)。p38和JNK抑制剂可显著阻断细胞周期,处理后,G0/G1期细胞比例均有所上升。过表达DLEU1可显著提高细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的蛋白表达水平,而阻断p38和JNK可部分消除DLEU1对MMP-2和MMP-9蛋白表达的促进作用。Western Blot检测显示,DLEU1过表达细胞骨桥蛋白(OPN)蛋白表达水平明显上调,平滑肌22α(SM-22α)蛋白表达显著下调,经p38抑制剂和JNK抑制剂干预后,OPN蛋白表达水平明显降低,SM-22α蛋白表达水平上调。结论:高血压时DLEU1介导的VSMCs增殖和表型改变需要p38/JNK通路介导。

GSTP1通过调节JNK通路抑制癫痫大鼠海马区星形胶质细胞炎性激活

目的明确谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)对星形胶质细胞炎性激活的影响及相关分子机制。方法10周龄雄性SD大鼠采用腹腔注射氯化锂建立癫痫模型(n=8)并收集海马区脑组织。大鼠原代星形胶质细胞给予不同浓度脂多糖(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)诱导处理48 h。利用蛋白质印迹检测组织与细胞中GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平,以酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-1β、IL-6浓度,以高效液相色谱测定谷氨酸(Glu)浓度。将GSTP1过表达载体瞬时转染至脂多糖诱导星形胶质细胞,并给予茴香霉素处理,观察星形胶质细胞炎性激活情况。结果癫痫大鼠海马区脑组织中GSTP1蛋白表达水平低于正常大鼠,而p-JNK蛋白表达水平与TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度高于正常大鼠(P<0.05)。GSTP1与p-JNK蛋白表达水平呈负相关(P<0.05)。脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活,表现为GSTP1蛋白表达水平呈剂量依耐性降低,而p-JNK蛋白表达水平与TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度呈剂量依耐性升高(P<0.05)。过表达GSTP1抑制脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活,而茴香霉素可以部分逆转GSTP1的抑制作用。结论GSTP1对癫痫大鼠海马区星形胶质细胞炎性激活具有抑制作用,其分子机制与抑制JNK通路激活相关。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过TRAF/TRADD激活JNK信号途径

为了探讨在鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活c Jun氨基端激酶 (JNK)信号途径的分子机制 ,利用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系L7,蛋白质印迹检测 ,发现LMP1能够促进JNK的活化 ;利用稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1及其三种突变体HNE2 LMP1ΔCTAR 1、HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR 1,2及LMP1阴性的HNE2 为材料 ,采用蛋白质印迹和报告基因法分析JNK和活化蛋白 1(AP1)活化情况 ,结果显示HNE2 LMP1和HNE2 LMP1ΔCTAR1中磷酸化JNK蛋白表达量和AP1活性都无显著差异 ,而与HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR1,2、阴性对照HNE2及空白载体转染细胞的JNK蛋白表达和AP1活性具有显著差异 ;进一步比较转染TRAF、TRADD显性负性突变体鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1中磷酸化的JNK量和AP1活性 ,结果显示 :TRAF DN和TRADD DN的导入使活化的JNK蛋白和AP 1活性显著降低 ,二者间无显著差异 ,提示TRAF和TRADD可能参与了LMP1对JNK和AP 1的活化 .以上结果提示在鼻咽癌细胞系中LMP1功能结构域CTAR2通过结合TRAF/TRADD激活JNK从而活化重要的转录因子AP1.

MK801对大鼠全脑缺血／再灌注ASK1信号通路影响以及神经元的保护

目的探讨MK801(dizocilpine,地佐环平)对全脑缺血/再灌注后神经型一氧化氮合成酶(nNOS)介导的凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)信号通路及海马CA1区细胞凋亡的影响。方法采用四动脉结扎法构建大鼠全脑缺血模型。SD大鼠腹腔注射MK801(30mg·kg-1)。通过"生物素转化法"(Biotin-Swich method)检测蛋白质的S-亚硝基化。然后运用免疫印迹、免疫共沉淀和免疫组织化学等方法对蛋白质的磷酸化以及蛋白质之间的相互作用进行研究;应用焦油紫染色的方法检测脑缺血/再灌注后海马CA1区的细胞凋亡情况。结果脑缺血/再灌注引起了ASK1的S-亚硝基化;MK801明显地抑制了脑缺血/再灌注诱导的ASK1的S-亚硝基化的增加;MK801明显降低了Thr845的磷酸化水平、增加了Ser83位的磷酸化水平,从而降低了ASK1的活性;MK801引起ASK1下游MKK4/7-JNK信号通路及下游凋亡的核通路也产生了相应的变化。结论 MK801能够抑制SD大鼠全脑缺血/再灌注引起ASK1的S-亚硝基化,进而影响ASK1凋亡信号通路,对神经元损伤起到保护作用。