绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的网络药理分析及基于TLR4/TRAF6/PI3KC3通路的协同抗炎作用

目的基于网络药理学和体外实验探究绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的机制。方法利用Swiss Target Prediction、PharmMapper、SEA和TCMSP数据库预测绿原酸和连翘苷的靶点,在GeneCards、OMIM、DRUGBANK和DisGeNET数据库获取细胞因子风暴的靶点,筛选交集靶点绘制Venn图,以STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络,采用DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞构建细胞因子风暴模型;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测巨噬细胞存活率;采用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)含量;以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TNF受体相关因子(TRAF4)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)蛋白表达。结果网络药理分析获得绿原酸联合连翘苷治疗细胞因子风暴的8个核心网络靶点[丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、低氧诱导因子1α(HIF1A)、IL-6、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、酪氨酸激酶(SRC)、Toll样受体4(TLR4)];富集关键通路包括PI3K/AKT信号通路等。体外实验结果显示,与对照组比较,模型组中NO、TNF-α、IL-6的释放量和iNOS、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.001)。与模型组比较,给药后NO、TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的水平均显著降低(P<0.001)。与单药给药组比较,绿原酸和连翘苷(1∶1)联合用药组炎症指标下降更明显(P<0.001)。与模型组比较,给药组TLR4、TRAF6、PI3K3C的蛋白表达和PI3K3C的磷酸化水平显著下降。结论绿原酸联合连翘苷能协同抑制促炎细胞因子的表达,调控细胞因子风暴,可能通过TLR4/TRAF6/PI3K3C信号通路实现。

反向PCR法构建TRAF6蛋白截短体质粒

目的:构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)截短体质粒pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C。方法:采用反向PCR法。结果:经双酶切鉴定,分别得到约900和750 bp的TRAF6截短体质粒pCMVMyc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C,符合预期;转染293FT细胞后,Western印迹检测到TRAF6 N和TRAF6 C的表达。结论:构建了TRAF6蛋白截短体质粒,有助于进一步验证TRAF6的生物学功能。

苦参碱对RANKL诱导破骨细胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1表达水平的影响

目的探讨苦参碱对RANKL诱导破骨细胞分化的影响及其可能的分子学机制。方法 RAW264.7细胞系培养,根据加入破骨细胞诱导剂RANKL及不同剂量苦参碱,分为空白组、诱导组、苦参碱低剂量组(0.5 mg/mL)、苦参碱中剂量组(1 mg/mL)、苦参碱高剂量组(2 mg/mL)。给药后48 h,qPCR、Western blot检测TRAF6、c-fos、NFATc1 m RNA及蛋白的表达,第7天TRAP染色观察多核破骨细胞,第9天qPCR检测Calcr、Ctsk mRNA表达,第12天甲苯胺蓝染色观察骨吸收陷窝。结果不同剂量苦参碱组中多核破骨细胞、骨吸收陷窝、Calcr mRNA、Ctsk m RNA表达量较诱导组减少。苦参碱不同剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量较诱导组明显下降(P <0.01),且呈剂量依赖性。空白组与苦参碱高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。与诱导组比较,苦参碱低、中、高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1蛋白表达量下降(P <0.05),且呈剂量依赖性。空白组与苦参碱高剂量组TRAF6、c-fos、NFATc1蛋白表达量比较差异无统计学意义(P> 0.05)。结论苦参碱可能通过抑制TRAF6、c-fos、NFATc1的表达,影响RANKL诱导破骨细胞的分化。

口腔癌组织中TRAF6的表达及其对细胞自噬、凋亡及NF-κB/c-jun信号途径的影响

目的:探讨口腔癌组织中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)的表达及其对细胞自噬、凋亡及NF-κB/c-jun信号途径的影响。方法:qRT-PCR和Western blot检测TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞系中的表达;qRT-PCR和Western blot检测沉默TRAF6在SCC-25细胞中的表达;EdU实验检测SCC-25细胞的增殖能力;Western blot检测SCC-25细胞中LC3Ⅱ/LC3 I比例;细胞免疫荧光染色检测SCC-25细胞中自噬体数目;流式细胞术检测SCC-25细胞的凋亡率;Western blot检测SCC-25细胞中NF-κB和c-jun蛋白的表达。结果:TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞系中高表达(P<0.001);沉默TRAF6使口腔癌细胞系中TRAF6的表达降低;沉默TRAF6使SCC-25细胞的增殖能力下降(P<0.01)、LC3Ⅱ/LC3 I比例下降(P<0.001)和自噬体数目减少(P<0.001);沉默TRAF6使SCC-25细胞的凋亡率升高(P<0.01),NF-κB和c-jun蛋白磷酸化程度降低(均P<0.001)。结论:TRAF6在口腔癌组织和口腔癌细胞中高表达,沉默TRAF6抑制SCC-25细胞自噬,增强SCC-25细胞的凋亡率及抑制NF-κB/c-jun信号途径的活性。