鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性

【目的】明确鸡肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用的具有叉形头相关结构域蛋白(TIFA)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的分子特征及其基因在鸡免疫器官中的表达特性,为后续深入研究TIFA和TRAF6相互作用调控家禽病毒NDV复制的作用机制提供理论依据。【方法】采用生物信息学软件结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,通过分析鸡TIFA和TRAF6蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、氨基酸同源性和结构域保守性及其在1~6月龄白来航鸡和新城疫病毒(NDV)感染SPF鸡后第3~5天的免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊),分别检测鸡免疫器官中TIFA和TRAF6基因的表达水平,进而研究鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性。【结果】鸡TIFA和TRAF6蛋白分别含有187和545个氨基酸残基,相对分子量约为21.8和61.9 kDa,其二级结构均主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。氨基酸同源性分析结果表明,鸡与火鸡TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性最高,分别为97.3%和98.2%,而与猪TIFA及小鼠TRAF6蛋白的氨基酸同源性最低,分别为51.1%和74.7%。同时,鸡TIFA蛋白的FHA结构域及TRAF6蛋白的RING、Zinc finger和MATH结构域均在禽类中保守性高。RT-qPCR分析结果表明,鸡TIFA和TRAF6基因在1~6月龄鸡免疫器官中均存在表达,但在脾脏中的相对表达量最高(47.94和10.84),而在法氏囊中最低(8.08和2.01),其中,TIFA基因在1月龄鸡免疫器官中表达量最高(22.15),在6月龄时最低(1.11),呈先减后增再减趋势,整体表达趋势呈倒“N”型模式;TRAF6基因在4月龄鸡免疫器官中表达量最高(7.13),在5月龄时最低(1.05),呈先降后升再降再升趋势,整体表达趋势呈“W”型模式。在NDV感染SPF鸡后的免疫器官中,TIFA和TRAF6基因的相对表达量均显著高于对照,其中,TIFA基因在第3天的鸡脾脏、第4天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高,而TRAF6基因则在第3天的鸡脾脏、第5天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高。【结论】鸡TIFA和TRAF6蛋白在禽类中的保守性高,两者在不同月龄鸡和NDV感染鸡的免疫器官中呈不同的表达水平和表达变化趋势,其参与的先天性免疫应答可能在抵抗NDV感染过程中发挥一定作用。

TRAF6基因对缺氧复氧肝细胞凋亡、Caspase-3、Caspase-9表达及线粒体膜电位的影响

目的探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因对缺氧复氧(H/R)肝细胞凋亡、Caspase-3和Caspase-9表达及线粒体膜电位的影响。方法人正常肝L02细胞分为对照组(不进行转染和H/R处理)、H/R组(细胞缺氧12 h,复氧12 h)、H/R+NC组(转染NC后进行H/R处理)和H/R+si-TRAF6组(转染si-TRAF6后进行H/R处理)。Western blotting检测TRAF6、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达。流式细胞仪检测细胞凋亡率及膜电位变化。结果 si-TRAF6转染L02细胞后,细胞中TRAF6蛋白表达明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。H/R处理可明显上调L02细胞TRAF6、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达,促进细胞凋亡,降低线粒体膜电位,而抑制TRAF6蛋白表达可降低TRAF6、Caspase-3和Caspase-9表达,抑制细胞凋亡,提高线粒体膜电位。结论抑制TRAF6基因表达可降低H/R诱导的L02细胞凋亡,提高线粒体膜电位,下调Caspase-3和Caspase-9表达。

赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性,采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp),其中包含5′端非编码区50 bp,开放阅读框1 629 bp,3′端非编码区942 bp;该基因编码542个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为61670,理论等电点为6.01。SMART结构分析结果显示,TRAF6基因编码的蛋白包含1个RING结构域、2个锌指结构域、1个螺旋卷曲结构域和1个MATH结构域。系统进化树分析结果表明,赤眼鳟TRAF6与团头鲂TRAF6的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,在中肠中的表达量最低;经GCRV感染后,赤眼鳟脾脏和头肾中TRAF6均呈波动上调趋势,在24 h达到峰值,表明TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应。

东北七鳃鳗TRAF6基因克隆、表达分析及亚细胞定位研究

为研究TRAF6在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,研究通过克隆技术获得了东北七鳃鳗(Lethenteron morii)TRAF6基因的cDNA全长,命名为LmTRAF6。利用实时荧光定量方法(qPCR)分析了LmTRAF6在幼鱼和成鱼中各组织的表达情况以及在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染后脂肪体、鳃、肠和肾组织在不同时间点的表达量变化。利用双酶切技术构建pEGFP-TRAF6重组质粒并转染HEK293T细胞, 48h后进行荧光观察并拍照。结果表明, LmTRAF6的cDNA全长为2751 bp,开放阅读框(ORF)为1785 bp,编码594个氨基酸。其蛋白结构域高度保守,具有RING结构、两个锌指结构、环-环(Coiledcoil)α螺旋结构域和MATH结构域。通过系统进化树分析,发现LmTRAF6与哺乳类以及鱼类TRAF6的亲缘关系较近,与果蝇、中国对虾TRAF6的亲缘关系较远。qPCR结果显示, LmTRAF6在各组织中均有表达,在幼鱼的心脏、皮肤、鳃、肝中的表达量相对较高,而在肠中表达量相对较低。在成鱼的肾、鳃、肌肉中的表达量相对较高,而在心脏中表达量相对较低。成鱼LmTRAF6在铜绿假单胞菌感染后,鳃、肠和肾的表达量在24h达到峰值。细胞定位显示, LmTRAF6在HEK293T的细胞质和细胞核中均有表达。以上结果为进一步探究七鳃鳗中TRAF6在TLR信号通路中的作用奠定了理论基础。

秦川牛TRAF6基因多态及其与体尺性状的关联分析

牛TRAF6基因位于15号染色体上,含有七个外显子,共编码902个氨基酸,是生长发育相关的候选基因。本研究旨在分析陕西地区秦川牛TRAF6基因多态及其与体尺性状之间的关系。本研究针对秦川牛TRAF6基因外显子及部分非编码序列设计引物,利用DNA池做为模板扩增测序,在第六内含子17 628bp处发现1个SNP。通过运用PCRRELP方法对该位点多态进行分析,结果发现存在2种基因型,分为TT和TC。TT的基因型频率为0.9574,TC的基因型频率0.0426;等位基因T的频率为0.9787,等位基因C的频率为0.0213,TT的基因型频率显著高于基因型TC,为优势基因型,TT基因型个体各体尺性状数据普遍高于TC基因型个体。本研究首次对陕西地区秦川牛的TRAF6基因进行了多态性分析,在第六内含子处发现了基因突变位点,且该突变位点与秦川牛体尺和体重等重要生长性状有关,可以作为分子标记辅助选择的参考。

构建TRAF6基因3’非编码区荧光素酶报告质粒验证及与潜在靶基因TRAF6的靶向关系

背景:前期研究发现miR-146-5p在染氟成骨细胞凋亡时表达上调。目的:构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)基因3’非编码区(3’UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证miR-146-5p与其潜在靶基因TRAF6的靶向关系。方法:采用生物信息学方法预测mi R-146-5p与TRAF6基因的结合位点。采用PCR技术扩增TRAF6基因3’UTR片段,并克隆至p Yr-MirTarget载体,构建野生型重组双荧光素酶报告质粒。实验分6组:①6a-5p-核苷类似物+TRAF6野生型3’-UTR共转组;②无核苷类似物对照+TRAF6野生型3’UTR共转组(对照组);③miR-146a-5p-抑制剂+TRAF6野生型;④TRAF6野生型3’-UTR转染组;⑤p Yr-MirTarget空质粒转染组;⑥正常细胞组。分别将重组荧光素酶报告质粒与miR-146-5p和核苷类似物共转染Saos-2,同时设置无核苷类似物对照、miR-146-5p抑制剂阴性对照和空载p Yr-MirTarget-W3’UTR、TRAF6-W 3’UTR及正常对照。检测6组细胞中荧光素酶活性。将核苷类似物和miR-146-5pinhibitor以及无核苷类似物对照分别转染人成骨细胞Saos-2,裂解细胞提取蛋白后采用免疫印迹检测TRAF6蛋白表达水平。结果与结论:①共转染miR-146-5p mimics的Saos-2细胞中荧光素酶活性为10.103 0±0.558 5、对照组(无核苷类似物-TRAF63’UTR)荧光素酶活性为13.1400±0.7204、抑制剂(inhibitor)组荧光素酶活性为13.707 1±0.434 8、野生型TRAF6 3’UTR质粒的Saos-2细胞中荧光素酶活性为13.202 1±0.456 5。仅转染空质粒的细胞荧光素梅活性为14.706 2±0.441 6,Saos-2细胞中荧光素酶活性本底值为1.126 4±0.126 2。共转染miR-146-5p mimics组明显降低(F=715.789,P <0.000 1),其他3组间与对照组比较,差异无统计学意义(P> 0.05);②免疫印迹结果显示,与对照组比较,细胞转染miR-146-5p mimics后TRAF6蛋白表达水平明显下调;③结果说明,TRAF6与mi R-146-5p存在靶向关系。

鸡TRAF6和TIFA基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】分析肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)及具有叉头相关结构域的TRAF相互作用蛋白(TIFA)基因在贵州黄鸡不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展TRAF6和TIFA基因调控鸡的生长发育及二者相互作用调控鸡相关病毒复制打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增鸡TRAF6和TIFA基因编码区(CDS)序列,通过ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL及MegAlign等在线软件进行生物信息学分析;同时采用实时荧光定量PCR分别检测TRAF6和TIFA基因在鸡胚发育第14 d(E14d)、鸡出壳第1 d(H1d)、第7 d(H7d)和第14 d(H14d)不同组织中的表达情况。【结果】鸡TRAF6和TIFA基因CDS序列全长分别为1638和564 bp,编码545和187个氨基酸残基,对应的编码蛋白分子量约62和22 kD,理论等电点(p I)为6.14和5.18。鸡TRAF6蛋白二级结构中无规则卷曲占47.08%、α-螺旋占38.14%、延伸链占11.86%、β-转角占2.92%,鸡TIFA蛋白二级结构中无规则卷曲占51.87%、α-螺旋占27.81%、延伸链占16.58%、β-转角占3.74%,二者均以无规则卷曲和α-螺旋为主。TRAF6和TIFA基因核苷酸序列同源比对分析均显示鸡与火鸡的相似性最高,分别为96.4%和92.2%,符合物种进化规律,也表明TRAF6和TIFA基因在禽类中具有一定的遗传保守性。TRAF6和TIFA基因在贵州黄鸡不同发育阶段的眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌及腿肌中均有不同程度表达,且内脏组织的相对表达量普遍高于肌肉组织,以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和肌胃;从E14d发育到H14d,鸡TRAF6和TIFA基因在肺脏、肝脏和肌胃中的表达均呈先下降后上升的变化趋势,在眼球中则呈先上升后下降再上升的变化趋势,在脑组织、胸肌和腿肌的表达水平较低且趋于稳定。【结论】TRAF6和TIFA基因在鸡不同发育阶段各组织中均有表达,且以肺脏和肝脏中的表达水平相对较高,在脑组织、胸肌和腿肌中的表达相对较低,故推测TRAF6和TIFA基因相互作用对鸡的生长发育具有调控作用。

鸡TRAF6基因外显子区功能性SNP预测与分析

采用生物信息学方法筛选鸡TRAF6基因中的功能性非同义单核苷酸多态性(nsSNPs)位点。从dbSNP数据库中检索出TRAF6基因的8个nsSNPs,利用生物信息学软件PROVEN、SIFT、PhD-SNP和SNAP2分别对nsSNPs进行功能性预测;使用I-Mutant2.0和Mupro对突变位点氨基酸的稳定性进行预测;此外,利用Clustal Omega和Jalview对鸡TRAF6基因编码的氨基酸序列进行多序列比对和进化位点保守性预测。使用MutPred2预测突变可能造成的影响;最后使用Sopma和SWISS-MODEL软件分别预测TRAF6野生型和突变型的蛋白质二级结构和构建它们的三级结构。结果表明:从TRAF6基因的nsSNPs位点筛选出来3个有害突变位点rs736890315(S17R)、rs734934585(C20G)和rs734774178(V472E),其中V472E是四种软件共同筛选出的突变位点。V472E突变位点可能影响鸡TRAF6蛋白的功能,且所有位点突变都会使TRAF6蛋白稳定性降低。保守性分析显示,D16G、S17R和A307T为不保守位点,C20G、S40G、S40R、T42A和V472E为保守的功能性残基;MutPred2预测结果发现,V472E位点的突变导致蛋白质的稳定性改变,其他位点的突变均无显著影响;二级结构分析结果表明,鸡TRAF6蛋白主要以无规则卷曲和α螺旋为主,V472E、S40G和C20G这三个位点上的突变都导致了无规则卷曲百分比的提高和α螺旋百分比下降;三级结构分析结果发现,TRAF6蛋白的野生型和突变体的三级结构与二级结构预测结果一致。本研究预测发现V472E位点突变可能严重影响鸡TRAF6蛋白质的结构,V472E可能是鸡TRAF6基因的潜在功能性位点。

牛TRAF6基因的密码子使用偏好性分析

为揭示TRAF6基因的密码子使用特性及选择合适受体动物、最佳外源表达系统,运用CUSP、CHIPS和CodonW在线软件分析牛TRAF6基因的密码子偏好性,并与模式生物基因组以及其他物种TRAF6基因进行比较。结果表明:牛TRAF6基因大部分偏好使用以G/C结尾的密码子,其中偏好性较强的有CTG(RSCU≥2),并发现大部分物种的TRAF6基因表达水平较低,牛与家绵羊TRAF6基因密码子使用相似,牛TRAF6基因与小鼠基因组的密码子使用频率差异小于大肠埃希氏菌和酵母菌等2种模式生物基因组,故选择小鼠作为TRAF6基因的外源表达宿主。这一研究为TRAF6基因在动物遗传改良中合适受体动物、最佳外源表达系统的选择以及其表达水平的提高提供了一定的理论依据。

下调TRAF6基因表达对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响及其机制研究

目的探讨下调肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）表达对多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖的影响及其机制。方法采用RT-PCR及Westemblot技术检测TRAF6在MM细胞系KM3、U266、RPMl8226细胞及MM原代细胞的表达；构建TRAF6小干扰RNA（siRNA），转染RPMl8226细胞，荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot检测转染效率，CCK-8法测定不同浓度siRNA沉默TRAF6表达后细胞增殖情况，Hoechst33258／碘化丙锭（PI）双染法分析细胞凋亡率；Wester nblot法观察沉默TRAF6基因表达前后凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX表达情况和下游NF．KB信号通路蛋白的变化。结果TRAF6mRNA和蛋白表达水平在MM细胞系和MM原代细胞均明显增高，尤以MM原代细胞为甚。50nmol／LsiRNA转染RPMl8226细胞后TRAF6mRNA相对表达水平（0．49±0．24）明显低于未转染组（1．87±0．23）及阴性对照转染组（1．74±0．35）。siRNA干扰后细胞增殖受抑，且呈剂量依赖性。细胞凋亡率由11．20％上升到51．82％，同时Bcl．2蛋白表达下调、BAX表达升高，NF—wB通路蛋白P．p65、p52的活性下降。结论TRAF6在骨髓瘤细胞中表达增高，下调TRAF6表达可明显抑制骨髓瘤细胞增殖并诱导其凋亡，其作用可能与影响骨髓瘤细胞的NF—KB经典和旁路途径信号传递有关。

MyD88和TRAF6基因多态性对瑞舒伐他汀治疗高血脂炎症状态影响研究

目的探讨MyD88和TRAF6基因多态性对瑞舒伐他汀治疗高脂血症炎症状态的影响。方法通过PCR荧光定量探针法检测纳入患者TLR4(rs4986790),MyD88(rs7744),MyD88(rs6853),TRAF6(rs5030445),IRAK4(rs4251532)的基因分型,评价服用瑞舒伐他汀8周前后血浆中炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β,MCP-1,sVCAM-1的含量。评价突变基因携带者服药前后全血中血脂水平及炎症因子的含量,并与野生型等位基因携带者相比较。结果瑞舒伐他汀具有明显的降脂作用,能够降低血清中炎症因子的水平。MyD88(rs7744)和TRAF6(rs5030445)突变基因携带者血清中TNF-α和MCP-1水平明显降低,且与野生型患者相比有显著性差异(P<0.05)。突变基因携带者与野生型患者相比低密度脂蛋白胆固醇和C反应蛋白值明显下降(P=0.017和P=0.027;P=0.025和P=0.031)。结论MyD88(rs7744)和TRAF6(rs5030445)基因多态性可影响瑞舒伐他汀对机体炎症状态的抑制作用,影响其治疗高血脂炎症状态的疗效。