Enhanced Effects of TRAIL-endostatin-based Double-gene-radiotherapy on Suppressing Growth, Promoting Apoptosis and Inducing Cell Cycle Arrest in Vascular Endothelial Cells

This study examined the effects of TRAIL-endostatin-based gene-radiotherapy on cellu-lar growth, apoptosis and cell cycle progression in human vascular endothelial cells ECV304 in vitro. The expression of TRAIL and endostatin protein in ECV304 cells was detected by ELISA after the transfection of recombinant plasmid pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES and X-ray irradiation. Then MTT assay was used for determining the cellular proliferation, and flow cytometry (FCM) plus Annexin V and propidium iodide (PI) double-staining or PI single-staining were employed for the detection of apoptosis and cell cycle progression. The results showed that expression of TRAIL and endostatin protein exhibited a time- and dose-dependent change in ECV304 cells after pshut-tle-Egr1-shTRAIL-shES transfection in conjunction with irradiation. In the TRAIL-endostatin-based single- or double-gene-radiotherapy, the cell viability declined in a time- and dose-dependent manner, the percentage of cells at G2/M phase and apoptotic rate was increased, and the percentage of cells at G0/G1 phase was lowered as compared with those receiving radiotherapy alone. Moreover, TRAIL-endostatin-based double-gene-radiotherapy demonstrated better effects on growth inhibition, promotion of apoptosis and induction of cell cycle arrest in ECV304 cells than single-gene-radiotherapy.

hTERT基因核心启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的:构建了人端粒酶逆转录酶(humantelomeraseresersetranscription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)基因真核表达载体并观察其对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用。方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL基因片段。测序正确后,利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTER-Tpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。用脂质体转染法,将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞中,应用RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达情况,以流式细胞术检测TRAIL对卵巢癌细胞的细胞周期的影响及诱导凋亡的作用。结果:经酶切鉴定及测序结果证实,所构建的重组载体正确。转染hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL载体后,SKOV3细胞的增殖受到抑制,出现明显凋亡。结论:hTERT基因核心启动子在卵巢癌细胞中可特异性地调控其下游TRAIL基因的表达,并发挥其促凋亡作用。构建由hTERT基因核心启动子调控的表达载体,可能是一种新型和有希望的肿瘤治疗的途径。

TRAIL基因对人白血病Jurkat细胞生物力学特性的影响

本实验研究将人类肿瘤坏死因子相关凋亡配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand)的cDNA序列作为目的基因导入RevTet On后 ,利用在Jurkat中所建立起的四环素调控TRAIL基因表达系统 ,作为研究肿瘤细胞凋亡前后生物流变学特性变化的细胞模型。我们通过测量用强力霉素诱导TRAIL基因表达前后细胞生物力学特性的变化 ,研究TRAIL基因对Jurkat细胞生物力学特性的影响。结果显示TRAIL基因的表达对Jurkat细胞有明显的促凋亡作用。TRAIL基因表达后 ,细胞表面电荷密度减少 ,流动性下降。而且 ,本实验表明 。

TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡及其与FHIT基因突变关系的初步研究

目的 :分析原核重组表达的人可溶性 TRAIL分子诱导多种肿瘤细胞的凋亡 ,并观察凋亡作用与 FHIT基因突变的关系。方法 :观察人可溶性 TRAIL对 2 8株不同来源的肿瘤细胞和正常细胞的直接细胞毒作用 ,RT- PCR法分析部分细胞的FHIT基因缺失突变情况。结果 :1～ 10 0 mg/ L的重组人可溶性 TRAIL蛋白即可诱导 19株细胞 (包括人肿瘤细胞株 )如 1990(胰腺导管癌 )、MCF- 7(乳腺癌 )、A 5 4 9(肺癌 )、U 2 5 1(星形胶质瘤 )、Hep G- 2 (肝细胞癌 )、M85 (胃癌 )、CNE- 2 (鼻咽癌 )、Hep- 2(喉癌 )、AT- 2 9(结肠癌 )、3AO (卵巢癌 )和 B16 - MB(黑色素瘤 ) ,髓性恶性细胞如 Jurkat、K5 6 2、U937、6 T- CEM,鼠源性 S180(肉瘤 )、Ehrlich(腹水瘤 )和 L ewis(肺癌 ) ,以及人内皮细胞株 ECV 30 4等发生凋亡 ;而其他 9株细胞 ,如 SK- N - SH(人神经母细胞瘤 )、8898(人胰腺导管癌 )、He L a(人宫颈癌 )、SMMU 772 1(人肝癌 )、HL 6 0 (人白血病 )、COS- 7(猴肾 )、人成纤维细胞、L 92 9(鼠成纤维细胞 )、Wish(人羊膜细胞 )等需大于 10 0 mg/ L的 TRAIL才能使其凋亡 ;观察到上述部分对 TRAIL敏感的人源细胞的 FHIT基因有缺失突变 ,而不敏感的人源细胞 FHIT基因完整。结论 :原核表达的人可溶性 TRAIL 具有明显诱导多种?

人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA ,利用RT PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体 2 )基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET 2 8c(+ )上 ,构建表达质粒pET 2 8c(+ )TRAIL ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,筛选获得表达菌株BL pET 2 8c(+ )TRAIL。表达菌经 1mmol/L的IPTG诱导表达 4h后 ,产生大量的重组人TRAIL蛋白 ,SDS PAGE扫描计算机灰度分析表明 ,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的 40

TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究

目的 :构建鼠源TRAIL(mTRAIL)真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用 ,抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH5 10协同抑制肝癌生长作用。方法 :采用RT PCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒 ;体内、外进行基因转染 ;用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率 ,用TdT mediateddUTPnickendlabeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡 ;小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。结果 :用RT PCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA ,并克隆至真核表达载体pcDNA3 .1中获重组质粒pX1;以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H2 2细胞 ,可检测到肝癌细胞凋亡 ;肌肉内注射转染质粒DNApX1,通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长 ;pX1与FN多肽真核表达质粒pCH5 10有协同抑制肝癌生长作用。结论 :质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达 ;体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长 ;与FN多肽真核表达质粒pCH5

人Trail分子的克隆、表达及鉴定

目的 克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF -relatedapoptosis -inducingligand ,Trail)基因 ,并在原核细胞中进行有效表达及纯化后 ,获得有生物活性的Trail蛋白。方法 采用RT -PCR ,从激活的人淋巴细胞中扩增Trail胞外区cDNA ,将其克隆至载体 pGEM -T中 ,经酶切和测序后 ,亚克隆构建重组原核表达载体pGEX - 5X -Trail,转化大肠杆菌 (HBl0 1) ,并进行表达和纯化。结果 得到了Trail基因 ,构建了在HB10 1中表达的重组质粒 pGEX - 5X -Trail,纯化后 ,检测发现重组人Trail融合蛋白 (rhTrail)对人肝癌细胞株HepG2有诱导凋亡的作用。 结论 该文成功地构建了人Trail基因高效表达系统 ,所表达的rhTrail具有良好诱导肿瘤细胞凋亡的活性 ,为今后的深入研究打下基础。

结肠癌TRAIL耐药细胞株的建立及其耐药机制的初步研究

背景与目的以人结肠癌DLD1细胞株为载体,探讨恶性肿瘤获得性TRAIL基因耐药的可能机制。材料与方法用重组腺病毒介导的TRAIL基因(Ad/gTRAIL)反复处理人结肠癌DLD1细胞,得到耐药细胞群DLD1-TRAIL/R。通过MTT比色法和蛋白电泳,检测耐药细胞对Ad/gTRAIL杀伤作用的敏感性及其凋亡通路中信号分子的表达情况,分析其获得性耐药的可能机制。结果DLD1-TRAIL/R细胞对Ad/gTRAIL和重组TRAIL蛋白处理耐药,但对腺病毒介导的Bax基因处理仍然敏感。耐药细胞内Bcl-XL的表达明显升高,caspase-8的表达显著下降,未见明显的caspase-8活性裂解形式。结论人结肠癌DLD1细胞株经Ad/gTRAIL反复处理后产生特异性针对TRAIL基因的耐药,其发生机制可能与Bcl-XL表达上调和caspase-8表达下调有关。

腺病毒载体携带人TRAIL基因治疗H446小细胞肺癌的体外实验研究

目的评价携带人TRAIL基因的腺病毒载体对人小细胞肺癌细胞株H446的基因治疗功效。方法构建的携带人TRAIL基因的腺病毒Ad-hTRAIL,感染人小细胞肺癌细胞株H446以及人正常肝细胞株WRL-68,人正常成纤维细胞株MRC-5,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其杀伤肿瘤细胞的效能,流式细胞术(FCM)检测Ad-hTRAIL对细胞早期凋亡的影响,并进行RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达量。结果携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒Ad-hTRAIL对H446细胞的感染效率较高;感染72h后H446、WRL-68、MRC-5细胞培养上清中TRAIL的表达量分别为32.02、17.08、16.89μg.L-1,在MOI=1.0时,Ad-hTRAIL即可引起H446细胞明显凋亡;而在MOI=100时对正常细胞WRL-68、MRC-5也没有明显杀伤作用。结论Ad-hTRAIL能够强烈诱导小细胞肺癌细胞H446凋亡而对正常肝细胞及成纤维细胞无明显抑制作用,Ad-hTRAIL在小细胞肺癌的基因治疗方面有潜在的应用前景。

外源性TRAIL基因转染对胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因对大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡作用。方法 C6细胞在杜伯改良的Eagle培养基(DMEM),37℃,5%CO2条件下培养;质粒提取与转染;用Hoechst试剂盒检测C6细胞凋亡。结果转染重组质粒PDC315-TRAIL的C6细胞组凋亡率明显高于未转染的C6细胞组及转染空载体PDC315的C6细胞组(P<0.05)。结论外源性TRAIL基因可引起C6细胞凋亡。

TRAIL基因修饰联合阿霉素对大肠癌细胞株RKO作用的研究

目的:探讨肿瘤坏死因子(tumor necrsis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因联合阿霉素后,应用于人大肠癌细胞株RKO基因治疗的实验研究。方法:将重组腺病毒载体(Ad)介导的TRAIL基因作用于大肠癌细胞株RKO,并联合低剂量的阿霉素协同作用。通过MTT比色法与流式细胞仪研究分析其对RKO细胞的作用效果,并以RT—PCR检测联合应用阿霉素前后TRAIL基因的表达水平。结果:病毒载体对RKO细胞的生长有轻微的抑制作用,作用4 d抑制率为11.9％,但不增加RKO细胞的凋亡率。TRAIL对RKO细胞的生长抑制率及凋亡诱导率分别为50.1％和19.8％。联合阿霉素后,TRAIL对RKO细胞株的生长抑制率及凋亡率均有显著的增强作用,分别达60.3％及49.0％。RT-PCR结果提示联合应用阿霉素后,TRAIL基因的表达并未增强。结论:TRAIL能有效抑制RKO的生长,联合阿霉素后,其对RKO的生长抑制作用及凋亡诱导作用均明显增强。阿霉素不是通过增加TRAIL基因的表达来实现上述作用的。

不同化疗药物对结肠癌细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用

目的:探讨不同化疗药物对结肠癌DLD1细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用及其可能的机制。方法:将不同化疗药物联合重组腺病毒载体(Ad)介导的TRAIL基因处理对Ad/gTRAIL耐药的结肠癌DLD1-TRAIL/R细胞,通过MTT法检测治疗后肿瘤细胞的存活率,以评价化疗药物对TRAIL基因耐药的逆转作用;然后进一步在体内评价该逆转策略的有效性;接着通过Western免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能机制。结果:在体外检测了5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、阿霉素、氟脲苷、依立替康以及顺铂6种化疗药物对DLD1-TRAIL/R细胞TRAIL基因耐药的逆转作用,结果发现只有5-氟脲嘧啶和丝裂霉素能够使DLD1-TRAIL/R细胞对Ad/gTRAIL重新敏感。进一步的结果表明联合5-氟脲嘧啶和Ad/gTRAIL能在体内有效地抑制DLD1-TRAIL/R细胞来源的肿瘤生长,且该抑制作用明显强于其它对照组。结论:联合使用Ad/gTRAIL和5-氟脲嘧啶或丝裂霉素能在体内外有效地逆转DLD1-TRAIL/R细胞对TRAIL基因的获得性耐药,其中丝裂霉素的逆转作用可能与其诱导的Bax过度表达有关。

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。

重组腺病毒TRAIL基因联合抗EGFR靶向药物对肺癌细胞增殖的影响

目的:观察重组腺病毒TRAIL基因制剂联合抗EGFR靶向药物对H460肺癌细胞株及裸鼠移植瘤增殖的影响。方法:重组腺病毒TRAIL基因治疗制剂分别与EGFR信号通路靶向治疗药物Iressa、Tarceva、以及C225联合应用于H460肺腺癌细胞株,采用MTT法以及流式细胞仪检测不同用药方案的抗肿瘤作用;在裸鼠H460肺癌模型中验证重组腺病毒TRAIL制剂与C225的协同抗肿瘤作用。结果:在体外实验中发现Iressa和Tarceva可以增加重组腺病毒TRAIL基因制剂对H460肺癌细胞的抗肿瘤作用(P<0.05);重组腺病毒TRAIL基因制剂在体外实验中与C225并不存在协同效应(P>0.05),但在裸鼠H460肺癌模型中重组腺病毒TRAIL基因制剂与C225有明显的协同抗肿瘤作用(P<0.05)。结论:本研究初步探讨了基因治疗与靶向治疗的联合抗肿瘤作用,实验发现EGFR信号通路上的靶向治疗药物包括小分子酪氨酸激酶抑制剂以及EGFR单克隆抗体均可以增加重组腺病毒TRAIL基因制剂抗肺癌作用。

rsTRAIL诱导人肺癌细胞系A549的细胞凋亡表达谱变化研究

目的研究一定量的重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡基因表达谱变化。方法用50μg·L^(-1)的rsTRAIL处理人肺癌系A549细胞培养物,以未经药物处理的A549细胞培养物为对照,应用基因表达谱芯片技术进行细胞凋亡相关基因mRNA表达差异分析。结果经TRAIL处理后,所检测的96个细胞凋亡相关基因中,21个基因表达上调,17个基因表达水平下调。结论经TRAIL处理后,通过细胞凋亡相关的功能基因组群基因表达的正负调控,对人肺癌系A549细胞凋亡信号传导途径进行调控。药物处理不影响p53基因的表达变化。

内皮祖细胞介导TRAIL基因对小鼠肝细胞癌的治疗作用

目的:探索TRAIL基因转染内皮祖细胞对肝癌的治疗作用.方法:通过PCR扩增TRAIL基因,将TRAIL基因与pcDNA3.1载体连接,采用腺病毒转染入内皮祖细胞中,并用Western blot进行TRAIL基因的表达鉴定.建立小鼠皮下移植瘤动物模型,用携带TRAIL基因的重组腺病毒转染内皮祖细胞,经尾静脉注射,同时以生理盐水和空载腺病毒为对照,分别观察治疗效果.结果:经酶切及测序鉴定,TRAIL基因与pcDNA3.1的重组质粒构建成功.Western blot检测发现TRAIL基因转染入内皮祖细胞后有表达.转染TRAIL基因组的抑瘤率为47.77%,肿瘤体积平均值为0.791cm3±0.119cm3,肿瘤质量平均值为0.29g±0.04g,经统计学分析与对照组有显著性差异.结论:TRAIL基因成功转染入内皮祖细胞并表达,TRAIL基因转染内皮祖细胞可以明显抑制H22移植瘤的生长,且无明显不良反应.

TNF家族的新成员TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

目的 :克隆Trail基因cDNA全长 ,构建Trail的原核表达载体 ,从而建立其原核表达体系。方法 :通过抽提外周血淋巴细胞总RNA进行RT -PCR克隆TrailcDNA ,构建Trail的原核表达载体 ,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定 ,以温度进行诱导表达 ,通过SDS -page分析表达产物。 结果 :(1)克隆了Trail基因cDNA全长 ,DNA测序结果与报道的完全一致 ;(2 )构建了Trail基因原核表达载体 ;(3)将构建好的载体转化相应的宿主菌 ,诱导后得到了Trail蛋白表达产物。结论 :Trail基因cDNA的克隆将对于其抗肿瘤作用研究有重要意义 。

TRAIL、bcl-2在卵巢癌组织中的表达及其相关性探讨

目的:探讨TRAIL和bcl-2在卵巢癌组织中的表达及相关性。方法:用免疫组化SP法检测10例正常卵巢,20例良性卵巢肿瘤,60例卵巢癌组织中TRAIL蛋白和bcl-2蛋白表达情况,并进行二者间相关性分析。结果:(1)正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、卵巢癌中TRAIL蛋白的表达率分别为90.0%、80.0%、38.3%;bcl-2蛋白的表达率分别为0%、20.0%、55.0%。两者间比较:在正常卵巢,良性卵巢肿瘤中TRAIL蛋白、bcl-2蛋白的表达无差异(P>0.05);在良性、恶性卵巢肿瘤中TRAIL蛋白、bcl-2蛋白的表达有差异(P<0.05)。(2)在卵巢癌中TRAIL蛋白表达与组织学类型、病理分级无关(P>0.05),与临床分期期别密切相关(P<0.05);bcl-2蛋白的表达与组织学类型无关(P>0.05),与病理分级、临床分期期别密切相关(P<0.05)。(3)TRAIL蛋白表达和bcl-2蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。结论:TRAIL蛋白和bcl-2蛋白可能共同参与了卵巢癌的发生、发展过程。并且可能通过减少TRAIL蛋白表达,升高bcl-2蛋白表达,起到协同抑制肿瘤细胞凋亡作用,从而促进了卵巢癌的发生、发展。

肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达

为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM TVector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV2 2 0构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)可溶性胞外区在大肠杆菌中的高效表达

肿瘤坏死相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosis inducingligand,TRAIL) ,也称为凋亡素 2配体(Apoptosisin2Ligand ,Apo2L) ,是肿瘤坏死因子超家族成员 ,能够激发肿瘤细胞选择性地发生凋亡 ,并对正常组织细胞几乎无毒性。TRAIL通过细胞表达受体 ,即死亡受体 4和 5 (DeathReceptor 4 ,DR4andDeathReceptor5 )发挥作用 ,而大多数肿瘤细胞表面表达这 2种受体。为了深入研究TRAIL在肿瘤治疗中的价值 ,我们采用RT PCR方法克隆了TRAIL基因 ,并对其细胞外可溶性区域 (1 1 4 2 81氨基酸残基 )在大肠杆菌中进行了表达。重组的TRAIL可溶性蛋白占细菌总蛋白的 4 5 %以上 。