TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定

目的 制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白。方法 应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA ,克隆入PCR2 .1 载体 ,测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE hTRAIL。将重组质粒转入大肠杆菌M15中表达 ,经 1mmol LIPTG在 37℃条件下诱导 4h ,亲和层析柱纯化。用SDS -PAGE电泳和Westernblot鉴定表达产物。结果 所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子 ,分子量 30kD。表达量约为 2mg ml。结论 人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达 ,为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料。

猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.

TRAIL死亡受体通路蛋白抗肿瘤小分子多肽的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导细胞凋亡优先选择肿瘤细胞,而对正常细胞低毒性,具有潜在的抗肿瘤药物开发价值.随着肿瘤治疗研究的不断深入,小分子多肽物因分子量小、易穿过细胞膜且稳定性较强,已成为肿瘤治疗药物开发研究的一个热点.本文基于TRAIL死亡受体通路蛋白抗肿瘤小分子多肽物的研究及应用进行简要概述.

TRAIL分子靶点在肺癌治疗中的研究及应用

目前肺癌的发病率在全球范围内呈持续上升的趋势。在中国，肺癌的发病率和死亡率在所有肿瘤中是最高的。肺癌患者中，只有30％的非小细胞肺癌可以通过外科手术切除，但手术后5年存活率很低，生活质量也不高，晚期不能手术的患者通常只能采用常规化疗或放疗，毒副作用大，疗效不理想。因此，寻找新的肺癌治疗手段是目前亟待解决的难题。

TRAIL诱导突变细胞凋亡的分子机理——免疫监督机制的新模型

Burnet提出免疫监督学说已经快三十年了,现在对这一理论的理解已经深入至分子水平,如MHC、TCR分子在免疫监督中的作用.随着TNF超家族和TNF受体超家族研究的深入,尤其是FasL、TNF-α和它们的受体Fas、TNFR1结构和功能及它们的信号转导途径的逐步阐明,免疫监督已从细胞免疫水平向分子免疫水平过渡.本文在国内外对TRAIL及其受体研究的基础上,提出了一个免疫监督的新模型:突变细胞比正常细胞缺少某些细胞膜表面信号从而被机体凋亡信号所识别,机体利用凋亡信号诱导突变细胞凋亡的方式清除它们.这一机制的提出可能会补充免疫监督学说.

TRAIL抗癌作用的分子机制

TRAIL是近年新发现的一种凋亡诱导配体 ,它能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡 ,而使正常细胞逃逸其杀伤作用。TRAIL强大的凋亡诱导能力和选择性的杀伤作用 ,引起了广大研究者极大的兴趣。本文从TRAIL的结构功能开始分析 ,论述了TRAIL作用的分子机制 。

4-1BBL胞外区cDNA的克隆及鉴定

目的 研究共刺激分子4-1BBL对T淋巴细胞的作用,并进一步研究肿瘤的免疫治疗。方法 按照4-1BBL的基因序列,设计合成了可扩增4-1BBL胞外区的引物序列,用RT-PCR方法从急性B淋巴白血病Raji细胞系细胞中提取总RNA,扩增出4-1BBL胞外区片段,并克隆到载体中,经酶切鉴定后再进行序列分析。结果 所克隆的目的片段经EcoRI和XhoI双酶切和序列分析证明正确。结论 已成功地钓取4-1BBL胞外区基因并克隆到pMD-18载体上。

不同分子亚型乳腺癌组织中TRAIL蛋白表达及意义

【目的】探讨不同分子亚型乳腺癌组织中TRAIL蛋白(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,TRAIL)的表达差异及TRAIL与乳腺癌各临床病理因素之间的关系。【方法】采用streptavidin-perosidase(SP)法检测110例乳腺癌及12例乳腺良性病变组织中TRAIL蛋白的表达水平,分析不同分子亚型乳腺癌组织中TRAIL蛋白表达差异,以及TRAIL表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移以及Ki-67表达等临床因素的关系。【结果】与其他分子亚型相比较,TRAIL蛋白在Luminal B HER-2+型乳腺癌组织中的表达水平明显下调(P=0.035),在Ki-67高表达的乳腺癌组织中也发现了TRAIL表达水平下调(P=0.045),并且TRAIL在乳腺癌组织中的表达水平还受到肿瘤大小、淋巴结状态和TNM分期等因素影响(P=0.004、P=0.006、P=0.001),而不受乳腺癌的病理类型、癌细胞分级、肿瘤有无坏死和神经浸润及患者年龄等因素的影响。【结论】TRAIL蛋白在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达有显著差异,并且其与乳腺癌的临床分期、肿瘤大小、淋巴结有无转移等临床特征密切相关,可能有助于判断乳腺癌的预后。

胎膜早破产妇胎膜组织中氧化应激分子及TRAIL和NF-кB的表达意义

目的探讨胎膜早破(PROM)产妇胎膜组织中氧化应激分子及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、核因子-кB(NF-кB)的表达意义。方法足月PROM患者40例为观察组,同期住院分娩正常妊娠女性40例为对照组,所有受试者于分娩后立即剪取适量胎盘组织,采用放射免疫沉淀法检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、维生素E(Vit E),硫代巴妥酸法检测丙二醛(MDA)。采用免疫组化(SP)法测定胎膜组织RAIL、NF-кB的表达,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)测定胎膜组织TRAIL mRNA、NF-кB mRNA的表达。取胎盘组织,加入Trizol裂解液提取RNA,反转录进行PCR反应,采用RT-PCR技术检测内质网应激相关蛋白CHOP、GADD153的表达。结果观察组患者MDA、CHOP、GADD153高于对照组(P<0.05),CAT、SOD、Vit E低于对照组(P<0.05);观察组TRAIL、NF-кB阳性表达率高于对照组(P<0.05);观察组患者TRAIL mRNA、NF-кB mRNA高于对照组(P<0.05)。结论PROM的发生可能是多种因素综合作用及多种基因相互调控所致,患者存在氧化应激和凋亡过度增强,临床进一步探讨细胞凋亡、炎性因子及氧化应激损伤对PROM发病机制的意义,对减少PROM发生率、确保母婴安全有重要意义。

辐射诱导人TRAIL基因表达的腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建辐射敏感Egr-1启动子诱导人肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从pACCMV-hTRAIL质粒中扩增得到TRAIL基因片段,并将其连接到pMD19T载体进行测序,利用基因重组技术构建含有辐射诱导启动子Egr-1的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。结果:PCR扩增出约820 bp的片段,测序结果证实扩增片段的序列与GenBank公布(NM_003810)的一致。pshuttle-Egr1-hTRAIL用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切重组得到大小为3 540和4 299 bp的2个片段,用SmaⅠ酶切得到1 517、2 282和4 040 bp的3个片段,用BamHⅠ酶切得到3 304和4 535 bp的2个片段,与预期结果完全一致。结论:成功克隆了hTRAIL基因,并构建了辐射诱导表达的腺病毒穿梭质粒pshuttle-Egr1-hTRAIL。

mB7AP-exCD40L融合蛋白的分子设计及其在Pichia pastoris中的表达和生物活性

目的小鼠B7反义肽与小鼠CD40L胞外区融合蛋白(mB7AP-exCD40L)的分子模拟设计及其酵母表达体系的建立,研究其酵母表达产物的生物活性。方法分子模拟设计mB7AP-exCD40L;构建pPIC9K-mB7AP-exCD40L质粒并用电击法转化PichiapastorisGS115。Westernblot鉴定融合蛋白的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)研究mB7AP-exCD40L对淋巴细胞增殖的影响。结果构建的重组Pichiapastoris实现了mB7AP-exCD40L的分泌表达,表达蛋白质的相对分子质量约2.6×103,对MLR具有抑制作用。结论分子模拟设计的mB7AP-exCD40L在Pichiapastoris表达体系成功表达,为进一步研究mB7AP-exCD40L在抗移植排斥反应中的作用奠定了基础。

sTRAIL基因的表达、纯化及其生物学活性的初步研究

在原核表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (sTRAIL)分子 ,纯化表达产物 ,并进行初步的生物学活性的研究中 ,通过提取外周血淋巴细胞总RNA进行RT PCR克隆sTRAILcDNA ,构建sTRAIL的原核表达载体 ,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定 ,IPTG诱导表达。以发酵罐放大培养 ,SDS PAGE和Western blot确认表达 ,用亲和层析和阳离子层析纯化表达产物 ,使用L92 9、Qay肝癌、K5 6 2人白血病等肿瘤细胞鉴定活性。结果发现重组表达的sTRAIL融合蛋白占总蛋白的 39% ,单纯蛋白纯化后纯度达 95 % ,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL分子 ,能诱导几株肿瘤细胞凋亡。原核表达系统正确表达了TRAIL分子 ,并摸索了中试生产的条件 。

TRAIL在卵巢癌中的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）由Wiley等[1]于1995年首次发现,TRAIL的cDNA全长1769个碱基对,共编码1个含有281个氨基酸（人）的蛋白1个及含有291个氨基酸（鼠）的、相对分子质量为32500的跨膜蛋白。TRAIL的结构为Ⅱ型跨膜蛋白,C-末端区域暴露在胞外,编码基因定位于人染色体3q26,为第3个TNF超家族中的凋亡分子,能快速、有效地诱导肿瘤细胞凋亡,对大多数正常组织基本无毒性损害。

猪CD8分子α链胞外区基因片段在毕赤酵母中的表达

为了给猪CD8α分子单克隆抗体的研制提供高生物学活性的抗原,采用PCR方法从pGEM-T-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α分子的胞外区基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pCD8α-ED,在毕赤酵母中进行表达,并对重组基因工程菌的发酵时间、pH值进行了优化。结果表明,表达出约20ku的目的蛋白,诱导表达的最适pH值为5.0,诱导表达的最佳时间是120h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被鼠抗人CD8α多克隆抗体识别,在20ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有免疫活性结构。

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体胞外区基因原核系统的表达与纯化

肿瘤坏死因子相关凋产诱导配体（TRAIL）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员之一，能够诱导前列腺癌、膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞凋产，但不影响正常细胞。本研究旨存观察重组TRAIL融合蛋白（GST—rTRAIL）的表达，探讨其包涵体蛋白的复性和纯化方法。

降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 (HAb18GEF) ,将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET2 1a +。通过计算机辅助设计 ,对重组的HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下 ,利用密码子的简并性 ,通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后 ,转化感受态JM10 9 DE3宿主菌后 ,随机挑菌 3 7℃下用IPTG诱导表达。SDS PAGE、间接ELISA、Westernblot和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNAdotblot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明 ,成功地构建了HAb18GEF pET2 1a +及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达 ,而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在 ,高达 2 9 3 %。由于过表达和细胞渗漏 ,培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合?

可溶性人TRAIL分子对Jurkat细胞的杀伤作用

目的 研究可溶性人TRAIL蛋白 (sTRAIL)对Jurkat细胞的生长抑制效应及凋亡诱导作用。方法 通过RT PCR扩增人TRAIL分子胞外区 4 1～ 2 81的密码子 ,利用大肠杆菌DH5α表达该可溶性片段 ,经纯化和复性后 ,诱导Jurkat细胞 ,通过显微镜、台盼蓝排斥试验、MTT法、流式细胞仪和DNA断裂实验检测细胞增殖和细胞凋亡。结果 sTRAIL蛋白纯度达 90 %以上。用 0 .5～ 10 .0 μg/ml的蛋白诱导Jurkat细胞 12h以上细胞的生长和增殖即被显著抑制 ,并且观察到凋亡峰及DNA的片段化等凋亡的特征性变化 ,细胞的生长抑制率与凋亡率也呈剂量依赖和时间依赖关系。结论 利用大肠杆菌制备的sTRAIL41 2 81蛋白对Jurkat细胞具有明显的增殖抑制效应和凋亡诱导作用。

抗人白细胞分化抗原单克隆抗体在疾病治疗中的应用

白细胞分化抗原是白细胞在正常分化、成熟的不同阶段或活化过程中出现或消失的细胞表面分子.它们大都是穿膜的蛋白质或糖蛋白,由胞外区、穿膜区和胞浆区构成.它们参与免疫应答过程中免疫细胞的相互识别、活化、增殖和分化.由于这些细胞表面分子都是有功能的分子,与机体重要的生理或病理过程密切相关,因此它们的抗体有可能用于某些疾病的治疗.本文简要介绍了我国抗人白细胞分化抗原单克隆抗体及其衍生物用于治疗器官移植时抗排斥反应;异基因骨髓移植时预防移植物抗宿主病;治疗再生障碍性贫血及用于激活LAK细胞治疗肿瘤等的情况.同时对抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单克隆抗体,抗粘附分子单克隆抗体的应用前景也作了初步讨论.