TRAIL蛋白的表达、纯化和抗肿瘤活性

目的 利用大肠杆菌表达出TRAIL蛋白 ,并观察分离纯化后的TRAIL蛋白的抗肿瘤活性。方法 采用CaCl2 法将带有TRAIL(氨基酸 114 -2 81,含六聚组氨酸尾 )基因的pET d质粒转入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS ,IPTG诱导蛋白表达 ;使用Ni NTA层析柱分离纯化蛋白 ,SDS PAGE和Westernblot法鉴定TRAIL蛋白的表达 ;MTT法检测TRAIL蛋白的抗肿瘤活性。结果 我们分离纯化出分子量为 2 0 .1× 10 3 的蛋白 ,Westernblot法证实为TRAIL蛋白 ,MTT法检测出其有较高的抗肿瘤活性 ,呈现出较好的时效和量效关系。结论 成功地利用大肠杆菌表达、Ni NTA层析柱分离纯化出具有抗肿瘤活性的TRAIL蛋白 。

抑制c-FLIP_L表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究

目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的mRNA和蛋白表达的变化。Western blot法检测caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,MTT法检测联合应用RNAi+rhTRAIL和他莫昔芬+rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性。结果:特异性siRNA片段能显著降低A549细胞中c-FLIPL的mRNA水平和蛋白水平。他莫昔芬可以显著抑制c-FLIPL蛋白的表达。两者均可以实现caspase-8的活化,并促进rhTRAIL对A549细胞诱导凋亡作用,凋亡率从2.52%提高到64.5%和59.2%(P<0.05),他莫昔芬和siRNA均可显著促进rhTRAIL蛋白对A549细胞的增殖抑制作用,抑制率分别提高到73.2%和69.5%(P<0.05)。结论:靶向抑制FLIP蛋白表达能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的研究应用。

顺铂增强TRAIL蛋白诱导Caski细胞凋亡机理研究

目的:观察顺铂对TRAIL蛋白诱导子宫颈癌Caski细胞株凋亡的调节作用,并探讨其作用机理。方法:传代培养宫颈癌Caski细胞,依照所加药物不同,将细胞分为TRAIL组、顺铂组、TRAIL+顺铂组、TRAIL序贯顺铂组、顺铂序贯TRAIL组以及空白对照组,分别于加药后不同时间应用:(1)倒置显微镜观察细胞的生长状态;(2)MTT法检测TRAIL蛋白与顺铂单用、联用以及序贯应用对Caski细胞的生长抑制率;(3)Caspase-8活性检测试剂盒检测不同用药方式对Caski细胞Caspase-8活力的影响;(4)流式细胞术检测Caski细胞TRAIL受体DR4,DR5,DcR1,DcR2的表达,以及1.0mg/L顺铂作用细胞24h后表达量的变化;(5)半定量RT-PCR分析顺铂作用细胞8h后4种受体mRNA水平的变化。结果:(1)TRAIL蛋白和顺铂对Caski细胞有不同程度的生长抑制作用;(2)100ng/mlTRAIL蛋白和1.0mg/L顺铂单用作用24h细胞生长抑制率分别为35.44%、50.26%,联合应用后增至89.66%,联合用药与单独用药差异有统计学意义(P<0.05);(3)顺铂序贯TRAIL蛋白生长抑制率79.88%,TRAIL蛋白序贯顺铂55.73%,两实验组的差异有统计学意义(P<0.01);(4)Caspase-8活力在顺铂序贯TRAIL组的表达最强,为单用TRAIL组的1.52倍;(5)Caski细胞4种TRAIL受体均有表达,但表达丰度不同,顺铂可以上调死亡受体的表达;(6)顺铂处理细胞8h后DR4,DR5mRNA表达水平明显升高,DR4为对照组的1.40倍,DR5为对照组的1.57倍,差异有统计学意义(P<0.05);(7)用顺铂处理前后DcR1,DcR2表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Caski为TRAIL蛋白敏感细胞,顺铂通过上调死亡受体4、5表达、提高Caspase-8活性,增强TRAIL蛋白抑制子宫颈癌Caski细胞生长的作用;顺铂序贯TRAIL的配伍方式具有更强的诱导Caski细胞凋亡的作用。

Akt磷酸化在A549细胞抵抗rsTRAIL蛋白诱导细胞凋亡的研究

目的:研究Akt磷酸化抵抗rsTRAIL蛋白诱导肺癌A549细胞株凋亡的作用机制。方法:rsTRAIL蛋白和哌立福新单独和联合作用于细胞株A549,Western blot检测A549细胞中Akt磷酸化水平变化、c-FLIPLL表达水平变化、caspase-8蛋白活化变化情况。流式细胞术进行细胞凋亡检测。MTT法检测A549细胞增殖率。结果:Western blot结果显示,rsTRAIL蛋白可以导致A549细胞中Akt磷酸化水平的增加,哌立福新能够抑制A549细胞中Akt的磷酸化水平及c-FLIPLL表达水平,增强A549细胞中caspase-8的活化。哌立福新能提升rsTRAIL蛋白诱导A549细胞的细胞凋亡率至(76.5±3.02)%和杀伤活性到(83.2±2.54)%。结论:Akt磷酸化是导致A549细胞对抵抗rsTRAIL诱导细胞凋亡的重要原因,抑制其活性可以促进rsTRAIL蛋白发挥抗NSCLC的活性。

人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤细胞的凋亡

目的 探讨原核表达的凋亡激活因子———人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤、尤其实体瘤细胞凋亡的作用及与p5 3突变的关系。方法 PCR扩增人TRAIL密码子 114 2 81,JFl12 5大肠杆菌表达 ,复性并纯化该可溶性片段。电镜观察与荧光活化细胞分类器 (FACS)定量分析纯化产物对多种恶性肿瘤细胞的诱导凋亡作用。免疫组织化学 (ABC法 )分析各细胞株p5 3的突变。结果 人可溶性TRAIL蛋白经多步纯化后纯度达 90 %以上 ,蛋白可溶性好。在人乳腺癌MCF 7细胞 ,宫颈癌Hela细胞 ,肝细胞肝癌SMMC772 1、BEL740 2、740 5BEL细胞 ,肺巨细胞癌 95C细胞中观察到人可溶性TRAIL蛋白的诱导凋亡作用。上述细胞株p5 3免疫组织化学检测均呈阳性。结论 原核表达产物与真核表达产物一样具有明显诱导多种肿瘤细胞凋亡的活性。

TRAIL蛋白与顺铂联合应用对卵巢上皮性癌裸鼠腹腔移植瘤生长的抑制作用

卵巢上皮性癌（卵巢癌）被发现时多为晚期，且治疗效果较差，寻找新的、有效杀灭肿瘤细胞的治疗方法迫在眉睫。肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是导致细胞凋亡的重要的细胞因子，TRAIL能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织和细胞没有明显的毒性。本研究建立了人卵巢癌细胞系SKOV3的裸鼠腹腔移植瘤模型，探讨TRAIL蛋白与顺铂（DDP）联合应用对肿瘤生长的抑制作用，以及DDP对TRAIL受体的影响，为TRAIL应用于卵巢癌的生物治疗提供实验依据。

TRAIL、Caspase-8和NF-κB蛋白在人骨肉瘤中的表达及其与细胞凋亡的相关性研究

目的探讨TRAIL、Caspase-8和NF-κB在人骨肉瘤组织及骨软骨瘤组织中的表达规律及其与骨肉瘤细胞凋亡的相互关系。方法应用免疫组化方法,检测TRAIL、Caspase-8和NF-κB蛋白在43例骨肉瘤及15例骨软骨瘤中的表达,并经图像分析系统测量TRAIL、Caspase-8和NF-κB蛋白的平均光密度(OD)值;用TUNEL方法检测骨肉瘤及骨软骨瘤中细胞凋亡。结果TRAIL、Caspase-8蛋白在骨肉瘤中的阳性表达均低于骨软骨瘤组织(P<0.05);而NF-κB蛋白在骨肉瘤中的表达高于骨软骨瘤(P<0.05)。TRATL与Caspase-8蛋白在骨肉瘤中表达呈正相关(P<0.01);而TRATL与NF-κB蛋白在骨肉瘤中表达呈负相关(P<0.01)。骨肉瘤组细胞凋亡指数(AI)显著低于骨软骨瘤组(P<0.05);TRAIL、Caspase-8蛋白表达与细胞凋亡均呈正相关(P<0.01);而NF-κB蛋白表达与骨肉瘤细胞凋亡呈负相关(P<0.01)。结论TRAIL基因可能是诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子基础,参与了其发生发展过程中细胞凋亡的调控。Caspase-8作为影响细胞凋亡过程的因子,在骨肉瘤发生、发展中发挥作用。NF-κB在骨肉瘤细胞增殖与凋亡中具有重要作用。TRAIL、Caspase-8蛋白呈低表达,可能受NF-kB高表达的调控而不能诱导细胞凋亡。提示三者在骨肉瘤的发生、发展中起协同作用。

顺铂对TRAIL蛋白抑制子宫颈癌细胞生长的调节作用

宫颈癌是世界范围内威胁妇女生命健康的主要妇科恶性肿瘤，对于晚期和复发患者，化疗是主要的治疗方法，但其严重的副反应及肿瘤耐药是导致患者死亡的主要原因。因此，寻求高效、低毒的化疗药物用于宫颈癌的治疗，是急需探寻的课题。TRAIL蛋白是新近发现的肿瘤坏死因子（TNF）家族的成员，因其能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞的生长，有望成为新型的化疗药物。本研究观察TRAIL蛋白以及顺铂调节TRAIL蛋白对宫颈癌细胞株HeLa和Caski细胞生长的影响，探讨TRAIL蛋白用于宫颈癌治疗的可行性，并为临床应用提供新的思路和科学依据。

TRAIL死亡受体通路蛋白抗肿瘤小分子多肽的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导细胞凋亡优先选择肿瘤细胞,而对正常细胞低毒性,具有潜在的抗肿瘤药物开发价值.随着肿瘤治疗研究的不断深入,小分子多肽物因分子量小、易穿过细胞膜且稳定性较强,已成为肿瘤治疗药物开发研究的一个热点.本文基于TRAIL死亡受体通路蛋白抗肿瘤小分子多肽物的研究及应用进行简要概述.

TRAIL在HCC治疗研究中的新进展

肝细胞癌(HCC)是当今社会最常见的恶性肿瘤之一。手术切除仍是目前主要的治疗方法,但术后存在死亡率高、预后差等问题,因此寻求更加安全、高效的治疗策略尤为重要。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)家族的新成员之一,相关受体在治疗肿瘤方面具有良好的优势,是具有抗肿瘤作用的潜在靶点。近年来,基于TRAIL受体激动剂及其联合治疗策略已经投入临床HCC的治疗,并取得了不错的临床治疗预期。但随着HCC耐药的发展,针对现有机制的TRAIL受体激动剂似乎难以达到预期效果,因此深入探寻HCC耐药机制及其新的联合治疗策略,对于HCC治疗十分必要。本文主要对TRAIL在发挥治疗HCC中涉及的相关机制尤其是相关耐药机制以及近年临床上使用的TRAIL受体激动剂联合用药策略进行综述。

重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理。 方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性。 结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26％-57％。不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5％,而诱骗受体DcRl表达55％,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40％-88％),而DcRI表达很低(8％-17％)。rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高。ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性。 结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关。

氨茶碱对哮喘大鼠肺组织TRAIL的表达及支气管肺泡灌洗液中T淋巴细胞凋亡的影响

目的研究哮喘大鼠肺组织TRAIL的表达及支气管肺泡灌洗液(BALF)中T淋巴细胞凋亡情况,以及氨茶碱对其的影响。方法将大鼠分为4组:正常对照组、哮喘组、氨茶碱组及地塞米松组。应用免疫组织化学结合图像定量分析方法对TRAIL蛋白表达进行检测。急性分离大鼠BALF中T淋巴细胞,在植物凝聚素-P(PHA-P)的刺激下培养2 h,经流式细胞仪检测大鼠BALF中T淋巴细胞凋亡率。结果大鼠肺组织TRAIL呈组成性表达,哮喘时,其表达明显增加(P<0.05),氨茶碱可以减少哮喘大鼠肺组织TRAIL表达(P<0.05)。哮喘大鼠BALF中的T淋巴细胞凋亡率较正常大鼠明显下降(P<0.05),氨茶碱可以促进哮喘大鼠BALF中的T淋巴细胞凋亡(P<0.05)。结论氨茶碱可能通过抑制肺组织TRAIL的表达来抑制TRAIL的促炎作用,同时还可以通过促进哮喘大鼠气道的T淋巴细胞凋亡发挥抗炎作用。

顺铂通过抑制RIP活性增强rhTRAIL杀伤肺癌A549细胞

目的探讨顺铂(DDP)通过抑制受体相互作用蛋白(RIP)增强肺癌细胞A549对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)敏感性的分子机制。方法 Western印迹检测顺铂、Nec-1作用A549细胞后RIP的蛋白表达。MTT法检测联合应用DDP+rh TRAIL和Nec-1+rh TRAIL作用后A549细胞的生长抑制率。Western印迹检测DDP+rh TRAIL和Nec-1+rh TRAIL对A549凋亡相关蛋白caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测DDP+rh TRAIL和Nec-1+rh TRAIL作用后对A549细胞凋亡的影响。结果 DDP和Nec-1能显著降低A549细胞中RIP的蛋白水平,DDP、Nec-1联合rh TRAIL可以实现caspase-8的活化,促进rh TRAIL对A549细胞的杀伤作用,凋亡率从(5.9±4.93)%提高到(60.5±4.93)%和(64.1±5.17)%(P<0.01)。抑制率分别提高到(65.5±4.93)%和(76.3±9.52)%(P<0.01)。结论抑制RIP蛋白活性能增加A549细胞对rh TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rh TRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的应用。

RANKL、OPG、TRAIL在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的探讨骨肉瘤组织中RANKL、OPG、TRAIL蛋白的表达情况。方法采用免疫组织化学SP法测定RANKL、OPG、TRAIL蛋白在50例骨肉瘤、20例骨软骨瘤中的表达。分析其在骨肉瘤、骨软骨瘤中表达差异及与骨肉瘤临床病理特征之间的关系。结果 OPG在骨肉瘤中的表达明显高于骨软骨瘤(P<0.01);TRAIL在骨肉瘤中的表达明显低于骨软骨瘤(P<0.01)。OPG、TRAIL的表达与Enneking临床分期有关(P<0.01)。结论 OPG、TRAIL是骨肉瘤发生、发展的标记之一。

NDV7793活化的NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤及其机制研究

目的:研究NDV7793激活的NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,并探讨可能的相关机制。方法:用免疫磁珠分离法分离人NK细胞,用乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测不同血凝单位(25.6Hu,51.2Hu,102.4Hu,204.8Hu,512.0Hu)的NDV7793刺激NK细胞后对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,分别用ELISA法和流式细胞术检测活化后的NK细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及细胞膜表面的TRAIL蛋白表达水平。结果:人外周血NK细胞分离纯度达(90.6±1.15)%;NDV7793能提高NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,其杀伤效力(释放的LDH活力值)随着效靶细胞作用时间的增加及效靶细胞比的增大而增强;NDV7793能显著提高NK细胞TNF-α的分泌水平,其中204.8HuNDV7793刺激NK细胞12h后,TNF-α分泌水平达到高峰(0.184±0.01);102.4HuNDV7793刺激NK细胞16h后,NK细胞膜表面TRAIL表达达到高峰(22.77±1.8)%。结论:NDV7793能增强NK细胞对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,杀伤机制可能是和提高NK细胞分泌的TNF-α及上调细胞膜表面TRAIL蛋白有关。

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡配体的凋亡效应

目的研究重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)诱导细胞凋亡的生物学活性。方法应用RT-PCR方法检测TRAIL受体(DR4和DR5)表达;细胞数目分析采用CCK试剂盒;细胞凋亡应用PI染色并经流式细胞仪检测;线粒体膜电位观察采用JC-1荧光染料。结果重组可溶性TRAIL抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡;凋亡过程中出现线粒体膜电位的降低。结论此重组可溶性TRAIL具有诱导细胞凋亡的生物学活性。

人可溶性TRAIL基因的克隆及表达

为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体 (TRAIL )蛋白 ,应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA ,克隆入PCR2 1 载体 ,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体。将重组质粒分别转入COS 7和大肠杆菌M1 5中表达。用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS 7细胞中的瞬时表达 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot鉴定大肠杆菌中的表达产物。所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子 ,相对分子质量为 2 1 0 0 0 ,表达量约为 2mg/ml。所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL 60细胞凋亡的作用。上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白 ,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料。

靶向HPV 16-E5的siRNA对TRAIL诱导宫颈癌Caski细胞凋亡的影响

目的探讨靶向人乳头瘤病毒16早期蛋白5(HPV16-E5)的siRNA对TRAIL蛋白诱导子宫颈癌Caski细胞株凋亡的调节作用。方法 HPV16-E5特异性siRNA转染48 h后,RT-PCR检测HPV16-E5 mRNA的表达;流式细胞术及caspase-8活性检测试剂盒分别检测空白对照组、siRNA-E5单独作用组、TRAIL单独作用组、siRNA-E5+TRAIL作用组、无关序列RNA+TRAIL作用组细胞的凋亡率及caspase-8的活性水平;RT-PCR及Western blotting检测siRNA干扰后Caski细胞表面TRAIL死亡受体DR4、DR5的表达。结果 RT-PCR检测结果显示,转染48 h后,siRNA-E5组HPV16-E5 mRNA的表达较空白对照组和无关序列对照组下调(P<0.05);siRNA-E5+TRAIL作用组较TRAIL单独作用组相比细胞凋亡率明显增加(P<0.05),而无关序列RNA+TRAIL作用组较TRAIL单独作用组细胞凋亡率无明显变化(P>0.05);siRNA-E5组TRAIL受体DR4、DR5的表达较无关序列对照组、空白对照组无明显差异(P>0.05);caspase-8活性水平在siRNA-E5+TRAIL作用组明显较TRAIL单独作用组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向HPV16-E5的siRNA可增强TRAIL诱导宫颈癌Caski细胞的凋亡作用,其机制与增强caspase-8的活化有关。