鞘内注射TRESK基因重组腺病毒对坐骨神经分支选择性损伤大鼠的镇痛作用

目的研究鞘内注射TRESK基因重组腺病毒（p Ad/CMV/V5-DEST-TRESK）对坐骨神经分支选择性损伤（SNI）大鼠痛觉过敏的影响。方法雄性SD大鼠36只,随机分为6组（n=6）：Ⅰ组为空白对照组;Ⅱ组为假手术组;Ⅲ组为SNI模型组;Ⅳ组大鼠制备SNI模型后鞘内单次注射生理盐水25μl;Ⅴ组和Ⅵ组大鼠制备SNI模型后,鞘内分别单次注射滴度为1.31×109TU/ml的阴性腺病毒和p Ad/CMV/V5-DEST-TRESK。各组大鼠于术前1 d及术后1 d、3 d、5 d、7 d、14d分别测定机械痛阈和热痛阈;术后14 d检测L4,5术侧背根神经节（DRG）的TRESK蛋白表达。结果Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组术后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d的机械痛阈明显低于Ⅰ组（P〈0.05）,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组5 d、7 d、14 d的机械痛阈明显低于Ⅵ组（P〈0.05）;与术前比较,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组术后1-14 d的机械痛阈明显降低（P〈0.05）。Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显低于Ⅰ组（P〈0.05）,Ⅵ组L4,5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显高于Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组（P〈0.05）。结论鞘内注射p Ad/CMV/V5-DEST-TRESK可上调SNI大鼠DRG的TRESK蛋白表达,减轻SNI大鼠的痛觉过敏。

表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定

为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10^(10)pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10^(10)pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对仔猪的细胞与体液免疫应答效果。结果表明:Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量极显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.01),Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD4^(+)/CD8^(+)显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.05),重组空载体腺病毒组和PBS对照组之间的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量及CD4^(+)/CD8^(+)差异不显著(P>0.05)。免疫后第28,35,42,49天,Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的抗猪附红细胞体特异性IgG抗体效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子IL-4和IFN-γ水平极显著高于重组空载体腺病毒组与PBS对照组(P<0.01),重组空载体腺病毒组与PBS对照组之间差异不显著(P>0.05)。说明猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗可以诱导仔猪产生强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6重组腺病毒过表达载体的构建与鉴定

目的构建及鉴定携带小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6(NLRP6)基因(NM_133946.2)的过表达重组腺病毒载体。方法合成小鼠NLRP6基因的编码序列,经酶切后插入腺病毒载体(GL2003),转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α进行培养,挑取转化子,进行聚合酶链反应(PCR)鉴定后送测序进行比对。采用蛋白质印迹法(Western blot)验证重组质粒中NLRP6蛋白的表达。利用Admax包装系统获得重组腺病毒载体Ad-NLRP6,导入HEK293细胞,经扩增纯化后测定病毒滴度。结果双酶切及DNA测序证明NLRP6成功构建入表达质粒中,同时检测其携带的FLAG标签蛋白,表明NLRP6表达水平显著升高。包装并生产携带NLRP6的重组腺病毒,进一步将病毒感染HEK293细胞,Ad-NLRP6细胞表达绿色荧光蛋白提示感染成功,收集病毒,经扩增纯化后测定病毒滴度为4×10^(10)PFU/mL。结论成功构建携带小鼠NLRP6基因的过表达重组腺病毒载体,这一结果为进一步研究NLRP6分子学功能提供了有效工具。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

突变k-ras基因重组腺病毒的构建

目的 利用细菌内同源重组法构建含 1 2密码子点突变的k ras基因重组腺病毒。方法 用限制性内切酶kpnⅠ +xhoⅠ从载体pcDNA3 k ras1 2 (Val)中切出 1 2密码子点突变的k ras基因片断 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val) ,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒 ,PacⅠ酶切后用脂质体转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒Ad k ras1 2 (Val)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用穿梭质粒pAdTrack CMV中带有GFP报告基因 ,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果 利用CaCl2 法由pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val)和pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,可获得 2 5%左右的阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因 ,滴度为 1 .2× 1 0 1 2 pfu/ml。结论 细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法 ,具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点 。

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coliBJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Westernblot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶10000和1∶1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。

小鼠 noggin 基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10^(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。

携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack-PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础。方法采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度。结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010PFU/mL。结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体。

人类神经生长因子β基因重组腺病毒载体的构建

目的:为研究人神经生长因子β(hNGFβ)基因对慢性神经病理性痛的治疗作用,构建人类神经生长因子β基因重组腺病毒载体。方法:将hNGFβ外源性核酸片段插入到pBluescriptⅡSK(+)的XmaⅠ与XbaⅠ位点,构建成pBluescriptⅡSK(+)hNGFβ,再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV经KpnⅠ和NotⅠ双酶切后,构建成转移质粒pShuttleCMVhNGFβ,将该转移质粒经PmeⅠ酶切后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的感受态菌BJ5183,重组为pAdEasy1hNGFβ,经PCR鉴定后,LipoVec介导pAdEasy1hNGFβ转染AD293细胞,将透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定。并进行自动测序鉴定。结果:线性化的pShuttleCMVhNGFβ转化含pAdEasy1的感受态菌BJ5183,24h后获得了30%阳性重组质粒,经酶切得到一个大于20kb的大片段和一个4.5kb的特征性条带,PCR扩增出731bp片段。pAdeasy1hNGFβ经PacI酶切线性化后,转染Ad293细胞包装成表达hNGFβ的重组腺病毒。260nm处吸光值测病毒滴度为2.24×1012OPU·L-1。重组AdhNGFβ腺病毒质粒经上海基康生物技术有限公司自动测序鉴定为目的基因。结论:应用细菌内同源重组能快速构建AdhNGFβ,为hNGFβ基因在神经病理性痛中的应用奠定了基础。

细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。

表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性。子代重组腺病毒rAd-H5 HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010TCID50mL-1。rAd-H5 HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制。

应用AdEasier-1系统高效制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒

背景及目的:自杀基因疗法的瓶颈之一是自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平低。利用肿瘤特异性启动子来调控自杀基因使其在肿瘤细胞中特异性表达已成为肿瘤自杀基因研究的热点。研究证实血管内皮生长因子在绝大多数实体瘤细胞中都有过量表达而在正常组织中不表达或表达甚微,其过量表达与血管内皮生长因子启动子(vascularendothelialgrowthfactorpromoter,VEGFP)活性上调有关。为研究VEGFP可否提高TK自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平,本研究应用一种高效的重组腺病毒构建系统,即AdEasier-1系统制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒。方法:VEGFP自pEGFP-1-SV-VEGFP切下后插入pAdtrack载体上构建pAdtrack-VEGFP。用HindⅢ/XbaⅠ自pREP8-TK切出带polyA加尾信号的TK基因,亚克隆到pAdtrack-VEGFP中构建转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK。PmeⅠ酶线性化转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK,转化含腺病毒基因组质粒pAdEasy-1的细菌AdEasier-1,用25μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-TK,经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-TK,行酶切鉴定、PCR鉴定和测序。结果:卡那霉素抗性细菌只有两种,一种含pAdEasy-VEGFP-TK(大于33kb)。