中国卤虫早期胚胎发育相关基因的研究——卤虫幼体trh基因的整体荧光原位杂交技术的建立

中国卤虫(Artemia sinica)是重要的饵料生物,是当前海洋生物学研究的热点生物和重要的生物模型。本文报告了卤虫无节幼体整体荧光原位杂交(WFISH,whole-mount fluorescent in situ hybridization)技术,用于快速对卤虫早期发育相关基因的特定时空表达图式进行分析,有助于对卤虫早期发育相关基因功能进行鉴定。人工合成带有FITC标记的卤虫trh基因(trachealess gene)寡核苷酸探针,检测到trh基因在卤虫无节幼体的头部背面盐腺中表达。

不同鸭种胚胎期和出雏早期下丘脑TRH基因mRNA的表达及其与生长发育的相关性研究

采用实时荧光定量PCR方法研究了生长速度不同的高邮鸭和金定鸭13、17、21、25、27胚龄和出雏后7日龄下丘脑中TRH基因mRNA的表达水平,并分析了其与胚重或体重的关系。结果表明:两鸭种在13胚龄时已均可检测到TRH基因mRNA的表达,从21胚龄到出雏后7日龄,TRH基因mRNA的表达量均一直增加,且出雏后7日龄的表达水平均显著高于胚胎期;两鸭种在胚胎期没有显著差异,而在出雏后7日龄时金定鸭极显著高于高邮鸭;相关性分析表明,两鸭种下丘脑中TRH基因mRNA的表达与胚重或体重均极显著正相关。研究结果提示,下丘脑中TRH基因mRNA的表达具有显著的年龄依赖性及组织差异性,出雏后还具有明显的品种特征,其对鸭早期生长发育可能有正调控作用。

瑶山鸡TRH基因编码区序列变异及其与繁殖性状的相关性

为明确促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone,TRH)作为鸡繁殖性状辅助选育基因的可行性,采用PCR产物测序法对瑶山鸡TRH基因编码区进行序列变异检测,并与繁殖性状进行关联分析。结果表明:瑶山鸡TRH基因存在1个编码区变异位点、1个外显子非编码区变异位点和1个内含子区变异位点,编码区变异位点引起蛋白质相应氨基酸发生错义突变。外显子区A2699T、G3857T变异位点与300日龄产蛋量、首次就巢日龄、首次就巢持续时间、300日龄就巢次数存在显著或极显著关联。外显子区A2699T、G3857T位点可作为瑶山鸡繁殖性状选育的辅助选择标记。

沿海地区副溶血弧菌的表型及其主要毒力基因分布特征

为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与11.8%,提示浙江沿海地区广泛存在着致病性副溶血弧菌污染。将不同来源副溶血弧菌的tdh和trh基因进行序列测定,进化树分析发现,环境分离株中tdh基因与临床分离株中tdh基因区分为2簇,而环境分离株与临床分离株中trh基因之间却没有明显的差异。研究结果可为浙江沿海地区副溶血弧菌的风险评估提供参考。

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达

采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh-trh-tlh+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。

Cloning,Expressing,and Hemolysis of tdh,trh and tlh Genes of Vibrio parahaemolyticus

Vibrio parahaemolyticus (VP) is one of the pathogenic vibrios endangering net-cage cultured Pseudosciaena crocea,Fennerpenaeus chinensis, and shellfish in coastal areas of China. Several types of hemolysins produced by Vp have been characterized as major virulence factors.They are thermostable direct hemolysin (TDH),TDH-related hemolysin (TRH) and thermolabile hemolysin (TLH). In this study, we cloned tdh, trh, and tlh genes from the genome DNA of VP by polymerase chain reaction (PCR).We ligated the three genes into prokaryotic expression vector pET-28a (+),and transformed the recombinant plasmids into Es-cherichia coli BL21 (DE3). The expression of recombinant proteins was induced by isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside (IPTG). The recombinant proteins were expressed in a form of inclusion bodies and thus purified with Ni-NTA affinity chromatography. Western blotting results showed that recombinant proteins,TDH, TRH and TLH, could be recognized by rabbit anti-VP serum. The three purified proteins were renatured by gradient dialysis.The renatured proteins exhibited hemolytic activity except for TLH in the presence of phosphatidylcholine. These results not only are helpful for better understanding these genes' functions under a single factor level, but also provide evidence for VP vaccine engineering.

四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。

快速荧光定量PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法建立与应用效果评价的研究

目的:建立一种快速、特异、灵敏、定量检测副溶血性弧菌及其毒力基因的方法,用于副溶血弧菌性食物中毒的应急检测。方法:根据GenBank中副溶菌(AY-289609)全基因序列上不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血素基因(tdh)、耐热相关溶血素基因(trh)为靶序列,设计引物与Tagman探针并对模板DNA制备方法和PCR反应时间进行改进与优化以提高检测速度,采集食物中毒样本与国家标准方法进行现场平行比对。结果:本方法检测时间仅需30 min。检出限2×101cfu/ml,定量线性范围2×103cfu/ml^2×108cfu/ml,对77份患者粪便增菌前后平行检测结果显示该方法检出率明显高于国家标准方法并具有统计学意义(χ2=58.80,P<0.01;χ2=42.98,P<0.01)。与7种常见肠道细菌均无反应。对6个浓度的副溶血弧菌测定的批内标准差在0.10~0.56之间。结论:该方法可在30 min内完成粪便中副溶血性弧菌的tlh、tdh、trh的检测,具有灵敏度高、特异性好、结果稳定、抗杂菌与药物干扰能力强等优点。非常适合食物中毒的应急检测。

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。

副溶血性弧菌食物中毒分离株的血清型、耐药性及毒力基因检测

目的:了解闵行区副溶血性弧菌食物中毒事件分离株的主要流行血清型和相关生物学特征。方法:对检出的副溶血性弧菌采用血清凝集试验进行血清分型;采用平皿法进行耐药性检测;用PCR扩增法检测菌株的毒力基因(tdh,trh)。结果:在检出的56株副溶血性弧菌中,腹泻肛拭来源有54株,其中tdh阳性trh阴性的O3:K6型菌株有49株;tdh阳性trh阴性的O4:K8、O1:K25型菌株各2株。食品留样分离株共2株,1株血清型为O1:K56,另一株不能分型,tdh和trh都为阴性。药敏结果显示,对青霉素类抗生素大部分或完全耐药,对氨基糖甙类、喹诺酮类、磺胺类高度敏感。结论:引起闵行区副溶血性弧菌食物中毒的菌株以携带tdh基因的O3:K6型菌株为主。

杭州市下城区副溶血性弧菌菌群菌型分布、毒力基因及耐药性研究

目的:通过对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)食物中毒分离株菌群菌型、毒力基因、耐药性检测分析,掌握VP血清群型、毒力基因及耐药状况。方法:按国标方法进行分离鉴定,药敏试验采用K-B法,毒力基因采用普通PCR法。结果:341株VP分属9个血清群15种血清型,前四位占96.19%,依次是O3、O4、O1、O2血清群,余五个血清群占3.81%。血清型以O3:K6为主,O4:K8型次之。282株VP携带tdh,仅1株携带trh,58株不携带毒力基因,无同时携带tdh和trh菌株。341株VP对诺氟沙星、复方新诺明、阿米卡星、头孢噻肟、妥布霉素5种抗生素100%敏感,对阿莫西林、氨苄西林、头孢噻吩、庆大霉素、环丙沙星耐药程度各异。结论:本区VP引起的食物中毒以O3:K6型为主;82.69%的VP携带tdh;诺氟沙星、复方新诺明、阿米卡星、头孢噻肟、妥布霉素是临床首选的抗生素。

双毒力基因副溶血性弧菌引起食物中毒病原学分析

目的分析引起食物中毒的病原菌,掌握分离株生化、血清学、毒力基因、耐药性状况。方法采集患者肛拭子标本,进行分离鉴定、耐药性分析、血清学分型,实时荧光PCR法检测毒力基因tdh、trh。结果 3份肛拭子中分离出O3、O1 2株不同血清型的副溶血性弧菌;2株菌株均对氨苄西林耐药;1株同时携带毒力基因tdh和trh。结论这是一起由2种血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒,菌株携带双毒力基因可能是导致此次食物中毒患者临床表现较重的原因。

特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。【方法】将已报道的这3种基因的引物加入一个PCR反应管中,对引物浓度和退火温度进行优化,找到最佳引物比例和扩增条件。通过特异性验证、灵敏度验证以及方法间对比进行方法确认,其PCR产物使用全自动毛细管电泳分析系统进行分析。【结果】仅在91、269、485 bp处分别出现预期DNA扩增条带;纯培养条件下,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×101、6.6×102和6.6×101 CFU/mL;本底干扰物存在时,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×103、6.6×104和6.6×103 CFU/mL;模板DNA浓度检测限为1.36μg/L。检测进境海产品时,检测结果和FDA 2004标准结果一致,且更易辨认和判断。【结论】此检测方法的成功建立,为副溶血性弧菌及携带tdh和/或trh基因的致病性副溶血性弧菌的检测提供了一种准确、高效、便捷的分子技术手段。

基于环介导等温扩增法(LAMP)检测上海市售贝类产品中副溶血性弧菌的毒力菌株

基于环介导等温扩增法(LAMP)对上海市8-10月市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株(tdh和trh毒力基因)进行检测分析,共检测贝类样品180份,6个常规品种,实验同时采用PCR测定方法进行对比。结果表明,含tdh和trh毒力基因的副溶血性弧菌在市售贝类中的检出率分别是12.77%和11.66%,PCR的分析结果为11.11%和7.78%。对分离的毒力菌株进行血清型分型后发现了2株O3:K6型副溶血性弧菌,其中1株为毒力基因双阳性菌(tdh+/trh+)。2株O3:K6型副溶血性弧菌的PFGE条带型相似度较高(相似度>90%)。这些结果表明上海市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株存在一定的污染,应引起足够重视。双阳性O3:K6型副溶血性弧菌的出现值得关注,应对各血清型菌株尤其是O3:K6型副溶血性弧菌的流行情况加强监测。PCR检测结果对比分析表明,LAMP方法适用于贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株的检测分析。

感染性腹泻中副溶血性弧菌的监测与研究

目的：了解余姚市感染性腹泻中副溶血性弧菌的感染状况及其研究。方法：采集感染性腹泻病人的大便或肛拭标本,依据GB/T4789.7进行增菌、分离、生化鉴定、血清分型,最后进行药敏试验和PCR毒力基因检测。结果：2007-2008年共检验标本513份,检出副溶血性弧菌43株,检出率为8.38%。药敏试验：43株副溶血性弧菌对阿莫西林棒酸、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、头孢唑林、头孢哌酮、庆大霉素7种抗生素的耐药率分别为58.1%、55.8%、、44.2%、7.0%、4.7%、4.7%、4.7%,对另外13种抗生素均敏感。血清分型：43株副溶血性弧菌分布于O1、O2、O3、O4、O6、O11共6个O抗原群；其中以03群为主，占67．4％。毒力基因：有40株副溶血性弧菌检出含有tdh基因，检出率高达93．02％，均未检出trh基因。结论：检出的副溶血性弧菌以03群为主，占67．4％；对阿莫西林棒酸、青霉素耐药性最强，分别为58．1％、55．8％；93．02％的菌珠含有tdh基因，所有菌株均不含trh基因。

福建不同来源副溶血性弧菌的毒力因子检测

目的了解福建省不同来源副溶血性弧菌携带毒力因子情况,为副溶血性弧菌食物中毒的检测和研究提供参考依据。方法用PCR方法检测从食品及食物中毒病人分离菌株的毒力因子。结果食品和临床病人分离菌株均含tlh基因,不含trh基因;临床分离菌株均含tdh基因,而食品分离菌株均不含tdh基因或含量少。结论福建省副溶血性弧菌食物中毒与副溶血性弧菌的tdh基因有关,tdh基因可作为副溶血性弧菌致病性的特异性检测项目。

2006～2008年东莞市副溶血性弧菌毒力因子分析

目的：了解东莞地区2006～2008年副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）分离菌株毒力因子的变化情况。方法：用PCR法及神奈川实验检测毒力因子。结果：食物中毒分离菌株tdh、trh基因检出率分别为85.2%（127/149）、8.7%（13/149）,外环境分离菌株tdh、trh基因检出率分别为6.3%（3/48）、2.1%（1/48）,所有菌株神奈川实验阳性率达91.9%（137/149）。结论：东莞地区副溶血性弧菌致病力较强,致病菌株大多携带tdh基因,对市民身体健康的潜在危害较大,应进一步加强对副溶血性弧菌的监测研究。

深圳福田地区副溶血性弧菌分子分型数据库的建立与分析

目的研究深圳福田地区不同来源的副溶血性弧菌的病原学特征、毒力基因、血清型及分子分型特征情况。方法对本地区2007年-2014年107株不同来源的副溶血性弧菌进行血清型分型;采用荧光PCR方法对全部副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因检测;采用脉冲场凝胶电泳技术对其进行PFGE分型,并用Bio Numerics软件进行聚类分析。结果 107株菌株共得到22种不同血清型,主要血清型为O3∶K6、O4∶K8、O2∶K28、O4∶K13、O1∶K25、O4∶K34和O5∶K68等。主要毒力基因为tdh+trh-,其次为tdh-trh-。采用PFGE分型共得到58种不同电泳图谱,主要的图谱类型为K16O3K6N11.FT0001、K16O3K6N11.FT0009、K16O3K6N11.FT0008、K16O3K6N11.FT0002和K16O4K8N11.FT00-03。结论主要血清型菌株所携带的毒力基因一致,主要为tdh+trh-,其次为tdh-trh-;血清型O3∶K6和O4∶K8菌株被PFGE聚类分型的效力最高,分别分出19和11种亚型条带;血清型O1∶K25、O5∶K68和O11∶K36PFGE条带图谱与O3∶K6图谱相似,均携带tdh+trh-毒力基因,遗传关系接近,可能为O3∶K6的血清变异型。

食物链中副溶血性弧菌污染状况研究

目的:研究食物链中副溶血性弧菌污染状况,和分离菌株的tdh及trh基因的携带状况。方法:国家标准方法 GB/T 4789.7-2008方法进行分离与鉴定,PCR法测定tdh和trh基因。结果:872份样品中共分离出348株副溶血性弧菌。其中有84株拥有tdh基因,5株菌拥有trh基因。结论:食物链中淡水产品的副溶血弧菌高检出率进一步证实副溶血性弧菌的生存与传播能力已发生了较大的变化。