泛素化连接酶TRIM56在人肝细胞癌中的表达及其与预后和免疫浸润关系的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法分析泛素化连接酶TRIM56在人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其与预后和免疫浸润的关系。方法采用UALCAN和TIMER数据库分析TRIM56在不同肿瘤中的表达。采用UALCAN、TIMER、GEPIA和Human Protein Atlas数据库分析TRIM56在人HCC中的表达。采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析不同TRIM56 mRNA表达水平HCC患者的生存情况。采用TIMER数据库和GEPIA数据库对TRIM56的表达与肿瘤纯度及免疫浸润水平的相关性进行分析。采用GeneMANIA数据库筛选与TRIM56相互作用的基因,并使用DAVID数据库对其进行富集分析。采用STRING数据库筛选与TRIM56相互作用的蛋白质,并使用UbiBrowser数据库分析TRIM56可能的泛素化底物。结果GEPIA数据库和UALCAN数据库分析均表明TRIM56在人HCC组织中的表达水平升高,其表达水平与肿瘤纯度和免疫细胞的浸润水平有关(P均<0.05)。对于亚洲患者,TRIM56 mRNA高表达者的5年总生存率和无复发生存率均显著高于TRIM56 mRNA低表达者(HR=0.43,Log-rank P=0.029;HR=0.45,Log-rank P=0.016);而对于欧美患者,两者差异均无统计学意义(HR=1.37,Log-rank P=0.22;HR=0.70,Log-rank P=0.14)。基因互作及富集分析表明,TRIM56可能参与核苷酸修复和线粒体自噬等过程,TP53是评分最高的预测泛素化底物(0.867分),可能与TRIM56参与介导人HCC发生发展的机制相关。结论TRIM56可能与HCC的发生发展和免疫浸润有关,其高表达可能提高亚洲HCC患者的生存率,为进一步研究TRIM56在HCC中的潜在作用机制奠定了基础。

猪TRIM56全长及其截短体真核表达质粒的构建及蛋白的表达和定位

本研究构建了猪TRIM56(sTRIM56)全长及其截短体的真核表达质粒,并检测了其融合蛋白的表达和定位。首先,根据sTRIM56基因序列及结构特点,设计扩增全长及4个截短体的引物,提取猪肺泡巨噬细胞3D4/21的总RNA,RT-PCR扩增sTRIM56全长及截短体基因,并将其克隆至pXJ41真核表达载体,构建全长及其截短体的真核表达质粒。其次,将sTRIM56全长及截短体真核表达质粒转染HEK-293T细胞,Western blotting检测其蛋白表达;转染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,间接免疫荧光试验(IFA)检测其亚细胞定位。双酶切和测序结果显示,sTRIM56全长及截短体的真核表达质粒构建成功;sTRIM56蛋白约为82 kDa,与预期相符,各截短体蛋白条带也与预期相符;sTRIM56全长及4个截短体蛋白均主要定位于细胞质中。本研究结果可为后续深入研究sTRIM56蛋白及其不同结构域的抗病毒作用及分子机制奠定基础。

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID_(50))以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示,TRIM56敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929~2120位1192个碱基缺失,未检测到sTRIM56蛋白条带;敲除细胞系中PRRSV R98疫苗株病毒拷贝数、病毒滴度以及N蛋白表达均显著高于对照组。本研究为猪TRIM56抗病毒机制研究及PRRSV疫苗研发奠定了基础。

宿主TRIM56蛋白与猪瘟病毒N^(pro)蛋白的相互作用及其对猪瘟病毒复制的影响

目的分析宿主TRIM56蛋白与猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)N^(pro)蛋白之间的相互作用,并检测TRIM56对CSFV增殖的影响。方法 siRNA干扰法下调细胞中TRIM56表达后接种CSFV,利用Western blot及荧光定量RT-PCR法检测TRIM56表达下调对CSFV增殖的影响;利用免疫共沉淀技术(Co-IP)和Western blot法分析TRIM56与N^(pro)之间的相互作用关系;利用激光共聚焦试验检测TRIM56与N^(pro)共定位于细胞内的具体位置。结果下调TRIM56表达后接种CSFV,细胞中CSFV基因组拷贝数和滴度均明显升高。TRIM56与N^(pro)能特异性相互作用,并共定位于HEK 293T细胞的胞桨内。结论宿主TRIM56蛋白与CSFV的N^(pro)蛋白存在相互作用,并且能够负调控CSFV的增殖。