人参皂苷Rh2通过Egr-1/TRL4/mTOR信号通路抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和EMT

目的:研究人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用以及作用机制。方法:CCK-8法检测人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca-109增殖的影响;细胞划痕实验检测人参皂苷Rh2对食管癌Eca-109细胞迁移的影响;Western blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白表达水平。结果:人参皂苷Rh2能够显著抑制Eca-109细胞的增殖,且呈剂量依赖性;此外,人参皂苷Rh2显著抑制E-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白表达,并抑制Eca-109细胞迁移;人参皂苷Rh2显著抑制Egr-1、TRL4和mTOR的蛋白表达;进一步的研究结果表明人参皂苷Rh2通过抑制Egr-1/TRL4/mTOR信号通路抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和EMT。结论:人参皂苷Rh2能够抑制食管癌细胞Eca-109的增殖、迁移和EMT,其作用机制是通过介导Egr-1/TRL4/mTOR信号通路来实现的。这一结果能够为治疗食管癌的进一步研究提供分子基础。

瑞香素对脊髓损伤大鼠运动功能改善作用的TRL4/NF-κB信号通路机制研究

目的探讨瑞香素激活Toll样受体4/核转录因子kappa B(Toll like receptor 4/NF-κB,TRL4/NF-κB)信号通路对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经再生及功能恢复的影响,为促进SCI的分子机制研究提供依据。方法建立脊髓损伤实验大鼠模型,并分别于术后1 d、8 d、14 d、21 d和30 d,采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分和联合行为评分法(combine behavioral score,CBS)评分测试评价各组SCI大鼠治疗后的神经功能;采用相关试剂盒检测脊髓组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性及丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素-1β(interleukiN-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-10(interleukin 10,IL-10)的表达量变化;并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测术后各组脊髓组织中对实验大鼠脊髓组织中BCL2-Associated X的蛋白质(BCL2-Associated X Protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Caspase-3、细胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)、磷酸化酪氨酸激酶受体B(phospho-tyrosine kinase receptor B,p-TrkB)、TOLL样受体4重组蛋白(recombinant toll like receptor 4,TRL4)和核因子-κB p65(nuclear factor-kappa b p65,NF-κB p65)水平的影响。结果瑞香素能够显著性改善实验大鼠BBB评分和CBS评分结果,且联合用药治疗组效果优于单一药物的疗效。此外,瑞香素能够改善实验大鼠脊髓组织中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量,能够降低脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量;Western blot实验结果表明瑞香素对脊髓损伤诱发的凋亡相关蛋白异常表达具有显著的调节作用,并能够显著性调节BDNF/TrkB信号通路和TRL4/NF-κB信号通路。结论瑞香素改善脊髓损伤的作用机制与是激活TRL4/NF-κB信号密切相关。

芍药汤联合美沙拉嗪调控TRL4-ERK1/2-NF-κB信号通路改善溃疡性结肠炎的作用机制研究

目的 观察芍药汤(SYD)联合美沙拉嗪(MES)对溃疡性结肠炎(UC)大鼠的保护作用机制是否与其抑制Toll样受体4(TRL4)介导的细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的激活有关。方法 60只Sprague Dawley大鼠随机分为正常组(NG)、模型组(MG)、SYD 20 ml·kg^(-1)组、MES 0.2 g·kg^(-1)组及SYD 20 ml·kg^(-1)+MES 0.2 g·kg^(-1)组,每组各12只。5%葡聚糖硫酸钠溶液连续喂养7天制备UC大鼠模型,造模后连续灌胃给药14天,给药后第7天和第14天进行大鼠疾病活动指数(DAI)评分。ELISA检测大鼠血浆炎症介质白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和炎症小体NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)的含量。HE观察结肠病理变化,免疫组化法检测结肠黏蛋白2(MUC2)蛋白表达。qPCR检测结肠MUC2、NLRP3、IL-1β和IL-6 mRNA的表达。Western Blot检测结肠NLRP3、IL-1β、IL-6、TRL4、髓样分化因子88(MyD88)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化核因子κB抑制因子α(p-ⅠκBα)和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达及细胞核内NF-κB p65水平。结果 与MG相比,SYD组及MES组肠黏膜病理损伤明显减轻、DAI评分显著降低、TRL4和MyD88的蛋白表达及ERK1/2、ⅠκBα和NF-κB p65磷酸化水平明显降低,同时NF-κB p65核转移显著减少、炎症因子IL-1β、IL-6和NLRP3的水平明显降低、MUC2蛋白的表达明显升高(P<0.05、P<0.01)。但与SYD组或MES组相比,SYD 20 ml·kg^(-1)+MES 0.2 g·kg^(-1)组肠黏膜损伤程度、DAI评分及NLRP3、IL-1β和IL-6的表达水平进一步降低,MUC2蛋白表达进一步升高,同时TRL4、MyD88的蛋白表达及ERK1/2、ⅠκBα和NF-κB p65磷酸化水平及NF-κB p65的核转移程度进一步降低(P<0.05)。结论 芍药汤联合美沙拉嗪对UC的疗效都优于单用美沙拉嗪或芍药汤,其机制可能与其抑制TRL4受体介导的ERK1/2、NF-κB信号通路活化,进而抑制炎症因子NLRP3、IL-1β和IL-6的表达、上调黏蛋白-2的表达有关。

温阳化浊清解方对Hp感染GES-1细胞IceA 、SabA基因及HSP70、TRL4表达的影响

目的探讨温阳化浊清解方对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染人胃黏膜上皮细胞(GES-1)IceA、SabA基因及HSP70、TRL4表达的影响。方法制备幽门螺杆菌感染GES-1体外模型。实验分组为空白组、模型组、西药组、低、中、高浓度中药组(10,20,40μg/ml)。空白组为正常人GES-1细胞,不予任何处理;模型组为Hp感染后人GES-1细胞;西药组为标准四联杀菌药干预;低、中、高中药组分别以上述浓度中药进行干预。干预完成后,采用PCR法分别检测各组细胞中幽门螺杆菌IceA、SabA基因表达,采用Western斑点印迹技术进行HSP70及TRL4表达水平的检测。结果IceA1、IceA2、SabA模型组较空白组mRNA转录水平变化均明显上升,差异性明显(P<0.05)经药物干预后,各组mRNA转录水平均下降差异显著(P<0.05),温阳化浊清解方在降低IceA2mRNA转录水平表达方面存在量-效关系,随浓度梯度升高而增强。SabA基因mRNA转录水平变化,高浓度中药组优于其余几组,差异有特异性(P<0.05)。且在降低Sa-bA基因mRNA转录水平方面存在量-效关系。与空白组相比,各组样本TLR4、HSP70蛋白相对表达量及IL8水平均升高(P<0.05)。与模型组相比,西药组、温阳化浊清解方各浓度组TLR4、HSP70蛋白相对表达量及IL8水平均明显降低(P<0.05)。结论温阳化浊清解方能增强Hp感染后人胃黏膜上GES-1活力,降低细胞凋亡率,抑制IceA、SabA基因表达和HSP70、TRL4蛋白表达,抑制IL8,减轻炎症,这可能是其抑制Hp相关胃炎的作用机制。

益气养阴活血法对脓毒症患者免疫功能的影响

目的探讨益气养阴活血中药（化纤胶囊）对脓毒症患者免疫功能的影响。方法将62例脓毒症患者采用信封随机法分为对照组（n=31）、治疗组（n=31）。对照组给予脓毒症西医常规治疗，治疗组在脓毒症西医常规治疗的基础上加用化纤胶囊中西医结合治疗。分析比较两组免疫球蛋白IgG和TRL4的差异。结果治疗组中西医结合治疗后IgG和TRL4水平较对照组单纯西药组明显下降（P〈0．05）。结论益气养阴活血中医化纤胶囊可有效地改善脓毒症患者的免疫功能。

五味子酯甲通过TLR4/NF-κB通路对肝纤维化的保护作用研究

目的观察五味子酯甲(Schisantherin A,SCA)对小鼠肝纤维化的保护作用,并初步探讨其作用机制.方法应用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导小鼠肝纤维化模型,SCA(4 mg/kg)灌胃给药治疗5周后检测小鼠血清中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)活性及肝组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量;ELISA法检测小鼠肝组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量;H&E及Masson染色检测小鼠肝组织损伤及胶原纤维表达情况;体外实验中,应用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导人肝星状细胞(LX2)的活化,应用Western blot法检测细胞中α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、MyD88及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)蛋白表达水平.结果与模型组比较,SCA给药组小鼠血清中ALT、AST活性、肝组织中Hyp、TNF-α、IL-6及IL-1β含量均显著降低(P<0.01),肝损伤明显减轻,肝组织胶原纤维的范围和面积明显减少.同时,SCA能明显抑制TGF-β1诱导的LX2细胞中α-SMA、TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达(P<0.05).结论SCA具有抗肝纤维化作用,其机制可能通过TLR4/NF-κB信号通路抑制肝星状细胞的活化及炎症反应发挥作用.

阿托伐他汀预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及炎症机制

目的探讨阿托伐他汀预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其炎症机制。方法45只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和预处理组,每组15只。预处理组每日给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)灌胃,其余2组每日等体积生理盐水灌胃,共干预2周。末次灌胃24h模型组和预处理组均制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型,假手术组仅分离血管不插入线栓。再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h行神经功能评分并收集外周血,术后72 h处死大鼠,采集脑组织,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积;采用ELISA检测各时点血清及72 h脑中TNF-α、NF-κB的表达。RT-PCR检测脑中TRL4、NF-κB mRNA表达。结果神经评分及TTC结果显示,模型组神经评分及脑梗死体积最大,预处理组神经评分及梗死体积显著减小(P<0.05)。ELISA结果显示,与假手术组比较,模型组和预处理组大鼠血清及脑TNF-α、NF-κB表达升高(P<0.05);与模型组比较,预处理组大鼠血清及脑组织TNF-α、NF-κB表达下降(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与模型组比较,预处理组大鼠脑组织TRL4、NF-κB mRNA表达下降(P<0.05)。结论阿托伐他汀可改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤,减小梗死体积。其保护机制可能与下调TLR4/NF-κB信号转导通路进而降低炎症因子TNF-α的释放有关。

升降散对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB信号的影响

目的研究升降散对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)TLR4表达及其下游NF-κB信号通路的影响。方法用不同浓度LPS(0、2、10μg/mL)诱导NR8383细胞,采用Real-time PCR和Western Blotting分别检测TLR4的mRNA和蛋白表达水平。用带有NF-κB的质粒转染NR8383细胞,双荧光素酶报告基因检测NF-κB活性,Western Blotting检测磷酸化p65表达水平,Real-time PCR检测细胞因子TNF-α、A20、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平,ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。将升降散作用于LPS成功诱导NF-κB上调的NR8383细胞,Real-time PCR、Western Blotting、双荧光报告基因检测和ELISA实验检测升降散在NR8383细胞中对LPS诱导NF-κB信号通路的影响。结果 LPS成功诱导NR8383细胞中NF-κB上调,在蛋白表达和mRNA表达水平均证实,LPS能梯度诱导TLR4高表达,且与LPS浓度呈正相关;同时,LPS能够诱导TLR4下游NF-κB的激活,增加下游靶基因编码细胞因子的合成与分泌,且与LPS浓度呈正相关。10μg/mL升降散作用NR8383细胞后,能抑制LPS诱导TLR4的高表达和下游NF-κB的激活。结论 LPS能梯度诱导NR8383细胞中TLR4的高表达及其下游NF-κB的激活,升降散能够显著抑制该诱导作用。

竹节参皂苷通过Toll样受体4/核因子-κB信号通路调控免疫功能对肺癌大鼠模型的影响

目的:研究竹节参皂苷对原发性肺癌的治疗作用以及对Toll样受体4(TRL4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调控作用,阐明竹节参皂苷治疗原发性肺癌的作用机制。方法:大鼠灌注碘化油液诱导原发性肺癌模型。造模后1周,竹节参皂苷溶于生理盐水后灌胃给药,连续20周。观察大鼠的一般状态,计算肺癌肿瘤组织的体积和数量,ELISA测定炎症因子表达情况,流式细胞术测定CD 3^+、CD 4^+、CD 8^+免疫细胞数量,Western blot测定TRL4、NF-κB p65和环氧合酶2(COX2)蛋白表达情况。结果:竹节参皂苷可有效抑制肿瘤体积增大和数量增加,减少咳嗽频率,增加CD 3^+和CD 4^+免疫细胞数量,减少CD 8^+数量,抑制血清中炎症因子水平。Western blot结果表明,竹节参皂苷可有效抑制TRL4、NF-κB p65和COX2蛋白表达。结论:竹节参皂苷可有效抑制原发性肿瘤增生,其作用机制可能是通过抑制TRL4/NF-κB信号通路调节机体免疫反应,抑制炎症状态。

热休克蛋白在大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用及机制

目的探讨热休克蛋白60(HSP60)在慢性吗啡镇痛耐受中的作用及机制。方法50只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=10)、吗啡组(n=10)、siRNA-阴性对照(siRNA-NC)+吗啡组(n=10)、siRNA-HSP60+吗啡组(n=10)与脂多糖(LPS)+siRNA-HSP60+吗啡组(n=10)。对照组和吗啡组分别于鞘内注射10μl生理盐水和吗啡;siRNA-NC+吗啡组和siRNA-HSP60+吗啡组分别给予10μl siRNA-NC和siRNA-HSP60,然后鞘内注射吗啡;LPS+siRNA-HSP60+吗啡组给予10μl siRNA-HSP60和LPS,然后鞘内注射吗啡。各组均连续处理7 d。采用RT-PCR和Western blotting检测大鼠脊髓组织中HSP60的mRNA和蛋白表达水平;采用水浴甩尾法观察沉默HSP60对疼痛耐受的影响;免疫荧光染色法检测脊髓小胶质细胞标志物OX-42的表达;RT-PCR法检测大鼠脊髓组织中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达;Western blotting检测大鼠脊髓组织中Toll样受体4(TLR4)和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的表达水平。结果鞘内注射siRNA-HSP60可显著下调吗啡诱导的HSP60的表达(P<0.05)。与对照组相比,吗啡组大鼠对疼痛的耐受度降低(P<0.05),HSP60缺失可增强大鼠对疼痛的耐受(P<0.05)。与siRNA-NC+吗啡组比较,siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中OX-42阳性细胞数以及IL-1β、TNF-αmRNA的表达显著下调(P<0.05),TLR4和p-p38MAPK的表达水平降低(P<0.05),而LPS处理可上调TLR4和p-p38MAPK的表达(P<0.05),并能逆转HSP60缺失对吗啡耐受的作用(P<0.05)。结论HSP60缺失通过抑制小胶质细胞的活化及炎症反应改善吗啡耐受的形成,其机制可能与抑制TLR4-p38MAPK信号通路有关。

TLR4/TRIF信号转导通路与支气管哮喘的关系研究进展

支气管哮喘(简称哮喘)的发病机制与免疫失衡有关,而Toll样受体连接天然免疫和获得性免疫,其中TLR4与哮喘发病密切相关。本文从TRL4/TRIF信号转导通路各信号分子的生物学特征、功能、调节及特异性拮抗进行综述。TLR4/TRIF通路的研究可能在将来的哮喘病理机制和药物治疗方面起到重要的作用。

TLR4-NOD2协同信号传递增强树突状细胞抗结核分枝杆菌感染的作用研究

目的研究TRL4-NOD2(T4N2)信号传递增强树突状细胞(dendritic cell,DC)抗结核分枝杆菌(MTB)感染机制,为结核病(tuberculosis,TB)的免疫防治提供参考。方法分别用TLR4配体LPS、NOD2配体MDP和T4N2双配体刺激DC后,ELISA法定量检测1h、6h、12h、24h和48h上清液中IL-6和IL-12。DC经MTB感染再用LPS、MDP以及T4N2双配体刺激,24h后分别收集细胞培养并计数细胞内生长的菌落数,判断细菌生长的抑制率。结果ELISA显示T4N2双信号刺激DC后,细胞因子IL-6在1h、6h、12h、24h和48h浓度分别为(86.4±0.34)pg/ml、(92.2±0.69)pg/ml、(93.6±0.69)pg/ml、(96.0±1.73)pg/ml和(107.8±4.53)pg/ml;IL-12在1h、6h、12h、24h和48h浓度分别为(94.6±4.07)pg/ml、(100.9±4.45)pg/ml、(97.9±2.96)pg/ml、(112.4±9.28)pg/ml和(132.8±1.49)pg/ml。不同时间段T4N2双信号刺激较LPS、MDP刺激显著增多(P<0.05);T4N2双信号活化的DC对MTB生长抑制率显著增强。结论 T4N2信号传递能协同增强DC的活化,活化的DC可抑制MTB的生长。