Ts21基因在旋毛虫不同期虫体的表达及特性的研究

目的观察旋毛虫Ts21基因在不同发育期虫体的表达及其特性。方法应用RT-PCR检测旋毛虫Ts21基因在成虫、新生幼虫、感染后15d的成囊前幼虫及感染后42d的成囊幼虫(肌幼虫)的转录情况;应用抗Ts21重组蛋白血清通过间接荧光抗体试验(IFA)对成囊前幼虫及肌幼虫冰冻切片抗原进行检测。应用抗Ts21重组蛋白血清对旋毛虫肌幼虫粗(可溶性)抗原及排泄分泌(ES)抗原进行Western-blot分析。结果RT-PCR发现旋毛虫成虫与感染后42d肌幼虫均扩增出一条分子量约540bp的特异性条带(Ts21基因目的条带),而新生幼虫与感染后15d成囊前幼虫则未扩增出目的条带;IFA结果表明抗Ts21重组蛋白血清只与感染后42d成囊幼虫抗原发生阳性反应,而不与感染后15d的成囊前幼虫抗原发生阳性反应。Western-blot结果显示抗Ts21重组蛋白血清只与旋毛虫肌幼虫粗抗原和ES抗原中Mr 21 000的单一蛋白条带发生阳性反应。结论旋毛虫Ts21基因的表达具有期特异性,Ts21蛋白是旋毛虫肌幼虫ES抗原中的一部分。

旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

目的 为进一步研究和应用旋毛虫Ts87基因 ,本文原核表达了PET - 2 8a(+) /Ts87重组质粒 ,并纯化鉴定了该蛋白。方法 将Ts87基因片段克隆入原核表达载体PET - 2 8a(+) ,形成重组质粒PET - 2 8a(+) /Ts87,转化后经IPTG诱导得到表达蛋白 (约 4 0kDa) ,利用固定化金属离子 (Ni2 + )配体亲和层析纯化目的蛋白 ,进行复性 ,并用兔人工感染旋毛虫血清鉴定表达产物。结果与结论 成功构建了PET - 2 8a(+) /Ts87,SDS -PAGE显示融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,经过亲和层析得到纯化的目的蛋白 。

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2蛋白基因,测序结果表明:序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99%;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Western blot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts8B2的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体,并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a(+)载体上,构建原核表达载体pET-28a-Ts43,酶切鉴定正确后,导入菌株Rosetta中,用IPTG诱导表达,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a-Ts43,IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白,与预测值相符。以0.9mmol/LIPTG诱导4.5h后表达量最高,薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%。Westernblot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功,为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。

猪囊尾蚴抗原基因Ts11的克隆及其在大肠杆菌的表达

PCR扩增重组噬菌体λTs11克隆的cDNA片段 ,与pUC18连接 ,得到的重组子用以测序 ,并进行同源性比较分析 ;将该片段克隆到原核表达载体pGEX 1λT中 ,免疫印迹筛选得到能正确表达该片段的重组子 ;制备该重组子在大肠杆菌中的表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和West ernblotting分析。结果表明Ts11cDNA片段为 52 2bp ,编码含 139个氨基酸残基的多肽 ,在Gen Bank和EMBL数据库均未发现同源序列。重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为 4 1KD ,能与兔抗猪囊尾蚴囊液血清产生很强的免疫反应。这些结果证实分离到一个新的编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的cDNA克隆。

猪带绦虫TS11抗原基因接种小鼠的免疫应答

本实验以猪带绦虫 TS11抗原基因的真核表达型质粒 VTS11肌肉免疫注射 BAL B/ c小鼠 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测小鼠脾淋巴细胞刀豆蛋白 A(Con A)刺激的增殖反应及 IL- 2的诱生活性 ;用 EL ISA方法检测免疫小鼠 Ig G总量和特异性抗体水平 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 VTS11免疫小鼠血清的特异性抗体滴度和 Ig G含量显著高于空白对照组小鼠 ;免疫小鼠脾脏淋巴细胞 Con A刺激增殖反应和 IL - 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;VTS11免疫小鼠的淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。这表明 VTS11免疫小鼠 ,可诱导其产生特异性的细胞和体液免疫反应 ,VTS11具有很强的免疫激活作用 ,可望成为预防猪囊虫病的一种新型疫苗。

猪囊虫抗原基因TS21的真核表达

构建了猪囊虫抗原基因TS2 1的VR10 2 0真核表达载体 ,以菌落原位杂交法筛选获得正确插入的重组质粒 ,用RNA印迹 (Northernblotting)和ELISA检测插入片段的转录及其翻译表达产物。结果 ,VTS2 1在真核细胞中能够转录TS2 1基因的mRNA ;兔抗猪囊虫超免疫血清可识别其蛋白表达产物 ,表明VTS2

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。

旋毛虫Ts43基因和内参基因标准品质粒及标准曲线的构建

为了构建旋毛虫Ts43基因和内参基因18S rRNA基因标准品和标准曲线,试验采用RT-PCR方法对目的基因进行扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy载体连接,转化到宿主菌DH5α中,筛选后得到重组质粒,对重组质粒进行酶切、质粒PCR和测序鉴定,经鉴定后的重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR,以制定标准曲线。结果表明:成功克隆了旋毛虫Ts43和18S rRNA基因片段,应用重组质粒制定的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线形关系,回归系数分别为0.999和0.992。说明试验成功构建了Ts43和18S rRNA标准品质粒和标准曲线。

猪囊尾蚴抗原基因TS11的真核表达研究

将猪囊尾蚴抗原基因 TS11亚克隆至 VR10 2 0真核表达载体中 ,用菌落原位杂交法筛选重组质粒 ,将其转染 COS7细胞 ,以 Northern Blotting检测插入片段的转录 ;用 EL ISA检查其翻译表达产物。结果表明 :VTS11在真核细胞中能够转录TS11基因的 m RNA;其蛋白表达产物能为兔抗猪囊虫高免血清所识别 ,在转染真核细胞 2 4 h后 ,即可检测到正确表达的猪囊尾蚴抗原蛋白。这些为深入研制猪囊虫的 DNA疫苗奠定了可靠的基础。

应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究

为研究旋毛虫Ts87基因的功能,通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达。针对Ts87基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA,通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达。此外,测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的变化。根据实时荧光定量PCR结果,dsRNA及siRNA均能有效抑制Ts87基因mRNA的表达。此外,两种RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率。实验表明,RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因Ts87表达,从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径。

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT-PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因,并克隆入pcDNA3.1-CT-GFP真核表达载体中构建重组质粒,用该重组质粒在脂质体介导下转染Vero E6细胞,GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液样品中有1条约66 ku的条带,可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,说明,真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达,表达产物具有抗原性。

玉米性别决定基因TS2的表达模式分析

[目的]TS2(tasselseed2)是玉米性别决定中的一个关键基因,国内外对其进行了多方面的研究,但其生理学功能至今仍然不清楚。本研究通过TS2基因的表达模式来阐明TS2的表达受什么信号物质刺激,从而推测TS2通过何种生理过程或信号转导途径来实现其在玉米性别决定中的作用。[方法]以玉米自交系B73苗期的叶片、茎尖、根,性别分化时期的穗位叶、雄蕊,开花期的雌蕊、节间、气生根、花丝为试验材料,在V3期(3叶1心期)喷施100μmol·L-1的GA、NAA、ABA、ACC、JA和2.5 mmol·L-1的SA溶液(含0.01%Tween-20),分别于激素处理后0、6、12、24、48、72 h时剪取第3叶中段为样本,采用荧光定量PCR测定TS2受激素诱导的表达量。[结果]TS2基因在已检测的各组织中都有一定量的表达。在叶片中TS2的表达从苗期到开花期逐渐增加,V8期(8叶1心期)叶片内的TS2表达量达到最高峰,以后逐渐下降。苗期(V1~V7)(1叶1心期到7叶1心期)茎尖中TS2的表达量一直很低,但到V8期,植株茎尖开始性别分化时,TS2的表达量迅速提高20多倍。雄穗、雌穗内TS2的表达量高于叶片或其他营养器官。植物激素GA、SA、NAA抑制TS2的表达,ABA、ACC、JA促进TS2的表达,但以JA对TS2的表达影响最大,JA处理后24 h,TS2的表达量提高了84倍。[结论]植物性别决定基因TS2的表达主要受植物生殖发育过程和植物激素茉莉酸信号的调控,预示着TS2的生理功能与植株体内茉莉酸信号转导途径密切相关。

旋毛虫43ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针。以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平。结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫。结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系。

Complete Genomic Sequence of Transmissible Gastroenteritis Virus TS and 3' End Sequence Characterization Following Cell Culture

The complete genome sequence of transmissible Gastroenteritis virus (TGEV) strain TS, previously isolated from Gansu province, was cloned and compared with published sequence data from other TGEV strains. Phylogenetic tree analysis based on the amino acid and nucleotide sequences of the S gene showed that the TGEV strains were divided into 3 clusters. TGEV TS showed a close evolutionary relationship to the American Miller cluster but had a 5' non-translated region (NTR) sequence closely related to the American Purdue cluster. Continued culture in different cell types indicated that TGEV TS virulence could be attenuated after fifty passages in Porcine kidney (PK-15) cells, and that the Porcine kidney cell line IB-RS-2 (IBRS) was not suitable for culture of the TGEV strain TS.

与乳腺癌细胞MCF-7相关的旋毛虫TS498基因的克隆与表达

目的克隆与乳腺癌MCF-7细胞相关的旋毛虫TS498基因,并进行原核表达。方法从含TS498基因的噬菌体文库中PCR扩增TS498基因,亚克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-TS498,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果扩增的旋毛虫TS498基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TS498经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,表达量约占菌体总蛋白的20%,能够被兔抗旋毛虫肌幼虫阳性血清识别。结论成功克隆并在大肠杆菌中表达了与MCF-7细胞相关的旋毛虫TS498基因,为进一步研究其特性和功能奠定了基础。

猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress（DE3）中的表达、纯化和兔抗血清的制备

目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向克隆到pGEX—1λT表达载体上，构建重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18，再用重组质粒转化大肠埃希菌（E．col）ArcticExpress（DE3）。用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达情况，亲和层析纯化获得重组融合蛋白。用纯化的重组蛋白按0．5mg／只与弗氏完全佐剂（CFA）混合，于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射；2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合加强免疫，此后每隔10d按第2次免疫法重复加强免疫，第4次免疫后6d，采集兔心脏血并分离血清，立即纯化及制备抗血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，采用蛋白印迹（Western blot）法鉴定抗血清的特异性。结果全基因合成的TS045W-4B—TSOL18融合基因片段长度为789bp。酶切证实pGEX—TS045W-4B—TSOL18重组质粒成功构建，测序结果获得的基因片段大小为789bp，与预期大小相符。SDS—PAGE分析和亲和层析后显示，重组质粒在转化E．col ArcticExpress（DE3）后，获得了相对分子质量约为55×10。的重组融合蛋白，纯度为85％。EUSA测定兔抗血清的效价为1：512000，Westernblot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约为55×10^3处出现1条与预期大小-致的特异性条带。结论成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18及制备了高纯度的TS045W-4B—TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清。

玉米性别决定基因TASSELSEED2及其同源基因的分子进化特征

TS2是最早在玉米中发现的性别决定基因,但是在其他的单性花或者两性花的被子植物中其同源基因是否也与花的性别形成有关以及其进化特征仍不清楚.以玉米性别决定基因TASSELSEED2(TS2)为检索序列,通过BLAST搜索得到21个测序植物物种的27个TS2同源基因,并利用生物信息学和比较基因组学方法详细分析了这些TS2基因的序列特征、进化关系及选择压力.结果表明,植物TS2基因具有3种基因结构类型、2种典型的功能结构域和7种保守基序组织模式,且单性花和两性花植物间并没有表现出特异性.系统进化树显示,以江南卷柏TS2蛋白为系统树基部,除了PtrTS2b、SlaTS2、CsaTS2和CpaTS2这4种单性花的TS2蛋白外,剩余22个植物TS2蛋白被划分为4个亚群.值得注意的是,除杨树外,其余4种单性花植物的TS2基因距离较远,均单独为一分支.进一步对4个亚群的选择位点分析发现,这些亚群共包含出24个正选择位点(P>0.05),说明各亚群TS2基因均受控于纯净选择或松弛的纯净选择.由上述结果可知,TS2基因在进化过程中发生了多次重复和基因扩增事件,而多次独立的重复或者基因扩增事件导致TS2基因失去了对性别的决定或者调控作用.

乳腺癌胸苷酸合成酶与氟尿嘧啶敏感性及预后的相关性研究

目的研究乳腺癌胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）在乳腺癌中的表达及与氟尿嘧啶敏感性及预后的关系。方法应用实时定量荧光PCR（RT—QPCR）技术检测80例乳腺癌组织中TS的表达，CAF方案对其行辅助化疗，研究TS与氟尿嘧啶敏感性的关系，并探讨TS表达与乳腺癌预后的关系。结果乳腺癌中TS基因阳性表达率为27．5％，TS基因表达与年龄，淋巴结转移，组织学分级，临床分期无明显相关性，与HER2的表达存在明显相关性（P〈0．01）。TS表达水平与5-FU的临床抗肿瘤效应呈负相关，TS表达阳性患者的5年生存率要明显低于表达阴性者（P〈0．01）。结论TS低表达的乳腺癌患者可从氟尿嘧啶类药物获益，TS可作为乳腺癌化疗的分子预测指标。