应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9)基因编辑系统在HEK293细胞系中对TSC1基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法根据TSC1基因的序列设计sgRNA,将sgRNA克隆到载体lentilCRISPRv2上,将连接产物转化至Stbl3感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot鉴定TSC1基因的表达。结果成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1基因的定点切割,Western blot结果显示细胞中无TSC1表达。结论用CRISPR/Cas9系统成功构建TSC1基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。