TSC21基因部分缺失对雄性小鼠生育功能的影响

目的:探讨雄性小鼠体内TSC21基因的生物功能。方法:C57BL/6J TSC21基因敲除杂合子雄性小鼠12只(实验组)和野生型雄性小鼠12只(对照组),比较交配后雌性小鼠产仔数目,泌尿生殖系统发育情况,睾丸质量和组织形态,以及精子密度和精子活率。结果:两组交配后雌性小鼠产仔数目、雄性小鼠睾丸质量、精子密度和精子活率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组雄性小鼠泌尿生殖系统发育情况,睾丸组织和精子形态均正常。结论:TSC21基因部分缺失对雄性小鼠生育功能未造成明显影响。

新基因TSC21的生物信息学分析及其原核载体构建表达

目的用生物信息学分析新基因TSC21并进行蛋白表达及纯化。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交并筛选出差异表达的基因。用生物学信息软件对该基因进行生物学信息分析。运用RT-PCR分析该基因小鼠不同组织及人不同组织中的表达。对人的TSC21基因进行cDNA克隆、蛋白表达及纯化。结果通过不同日龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达基因(GenBank登录号:NM-028825),全长有810bp,含有543bp的完整ORF,编码一个有180个氨基酸、分子量为21.040kDa的蛋白质,我们将其命名为TSC21。亚细胞定位预测显示TSC21基因可能在细胞核中表达。基因功能域预测表明在氨基酸34-40处有CK1和CK2磷酸化位点,在氨基酸100-106处有PKA(cAMP-dependent protein kinase A)磷酸化位点。RT-PCR分析表明TSC21基因特异性表达于小鼠睾丸组织。TSC21蛋白在人的同源基因GenBank登录号为NM-152670,在180个氨基酸区域内有82%的同源性,人TSC21(hTSC21)基因特异性地表达于人睾丸组织中。成功构建PET-28a2c(+)vector/hTSC21表达载体,并转化BL21,以IPTG诱导蛋白表达,对诱导剂浓度、诱导时间进行优化后以镍离子亲和层析纯化目的蛋白。结论TSC21基因在小鼠及人的睾丸组织中特异性表达并具有高度同源性,显示其可能在精子发生中起着重要作用。所得人TSC21蛋白可进行其蛋白结构活性、睾丸组织中的定位分布及在男性不育等疾病检测的研究。

小鼠TSC21基因敲除打靶载体的构建和胚胎干细胞同源重组克隆的鉴定

目的:构建小鼠TSC21基因敲除打靶载体,电转胚胎干细胞(ES细胞)并筛选同源重组阳性克隆。方法:订购含TSC21基因的129 BAC克隆,PCR扩增2对同源臂,利用PL253、PL452质粒进行目的片段的连接和同源重组,构建打靶载体并电转ES细胞,利用Southern blot方法鉴定同源重组阳性ES细胞克隆。结果:构建了TSC21基因敲除打靶载体,经过限制性内切酶鉴定及DNA测序鉴定,TSC21基因敲除打靶载体构建成功。Southern blot结果显示成功筛选到打靶序列同源重组阳性ES细胞克隆。结论:TSC21基因敲除打靶载体构建成功并筛选到同源重组阳性ES细胞克隆。

人睾丸特异性基因蛋白抗体制备及其在无精症睾丸组织中的表达

目的探讨人睾丸特异性基因(TSC21)蛋白在无精子症患者睾丸组织中的表达特征。方法构建人pET32a-TSC21表达载体,转化到感受态BL21细菌,诱导表达并纯化TSC21蛋白;免疫小鼠,制备抗人的TSC21多克隆抗体;应用免疫组化方法检测TSC21在健康者睾丸组织和生精阻滞患者睾丸组织中的表达差异。结果成功制备人TSC21的鼠源性多克隆抗体;TSC21蛋白在健康者睾丸组织中主要定位于精母细胞和圆形精子细胞;在生精阻滞的无精症患者中表达减弱。结论 TSC21蛋白对于睾丸发育和精子发生可能具有重要作用,其表达降低可能是男性不育症发生的重要原因之一。