多房棘球蚴抗原蛋白TSP3抗原表位的生物信息学预测

目的预测多房棘球绦虫抗原蛋白TSP3的二级结构和优势抗原表位(T细胞和B细胞表位)。方法 Genbank获取TSP3的氨基酸序列后通过生物信息学软件SOPMA预测二级结构特征,进一步通过在线软件IEDB、SYFPEITHI、Bcepred和ABCpred预测TSP3的T细胞和B细胞表位。同时对TSP3的亲水性、柔韧性、抗原性及蛋白表面暴露区域的特征进行预测。结果无规则卷曲和β转角分别占TSP3蛋白质的二级结构的25.68%和4.05%,说明潜在优势抗原性表位存在。通过多种生物信息学方法分析出TSP3潜在的T细胞表位为T33-42、T45-55、T53-63、T68-77、T80-90、T92-104、T110-122、T134-144;TSP3潜在的B细胞表位为T18-33、T45-55、T53-63、T64-75、T80-90、T92-104、T110-122。结论 TSP3的二级结构特征显示潜在优势抗原性表位存在,预测出8种T细胞抗原表位和7种B细胞抗原表位,为后续表位疫苗的设计奠定了理论基础。

多房棘球蚴蛋白TSP3的原核表达及分离纯化

目的构建适合融合基因pCzn1-TSP3的原核表达系统,纯化获得多房棘球蚴蛋白TSP3。方法 TSP3的基因序列在GenBank中获取,采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,构建原核表达质粒pCzn1-TSP3,并转化于大肠杆菌Arctic Express(DE3)中,经IPTG诱导,获得目的蛋白,利用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得目的蛋白。结果经生物公司测序及酶切鉴定结果证明重组质粒p Czn1-TSP3构建成功。进一步实验结果表明TSP3在原核表达系统中主要以可溶蛋白形式存在。继而经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得TSP3纯蛋白,并经过Western Blot证实。结论大肠杆菌Arctic Express(DE3)中能够成功表达蛋白TSP3,且Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱能够纯化目的蛋白TSP3。

微小隐孢子虫TSP3蛋白质的表达与功能

通过对微小隐孢子虫TSP3基因克隆构建原核表达载体,纯化TSP3 His-tag重组蛋白质免疫新西兰家兔,间接ELISA方法检测特异性血清效价并纯化多克隆抗体。纯化TSP3 GST-tag重组蛋白质并与HCT-8细胞进行共孵育,通过Western blot与间接ELISA检测细胞黏附特性。结果表明:成功构建了微小隐孢子虫p ET-TSP3和p GEX-TSP3重组表达质粒,并用亲和层析法成功纯化出较高质量的重组蛋白质。Cp TSP3重组蛋白质具有良好免疫原性,并能与HCT-8细胞黏附。

微小隐孢子虫TSP3蛋白的定位分析

通过对微小隐孢子虫TSP3氨基酸序列进行生物信息学分析设计多肽片段,偶联KLH载体蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA方法检测血清效价并利用特异性亲和层析的方法纯化抗体。以该抗体作为一抗,利用Western blot检测虫体天然蛋白质在体内的表达情况,通过间接免疫荧光方法进行亚细胞定位分析。结果表明:制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体天然蛋白,亚细胞定位发现其位于子孢子以及裂殖子的顶端。

细粒棘球绦虫TSP 3基因的生物信息学分析及原核表达

目的为分析细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)TSP3基因的生物信息学特性并表达其非跨膜区蛋白。方法本研究利用PCR扩增Eg-TSP3全长基因及非跨膜区序列,采用生物信息学软件对Eg-TSP3蛋白的理化性质、结构特点及亲缘进化关系进行分析;利用RT-QPCR分析TSP3在细粒棘球绦虫不同发育阶段中的相对转录水平;并构建重组质粒,经双酶切鉴定,将其转化至大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)后,采用SDS-PAGE检测TSP3蛋白的表达,通过western blot对蛋白进行抗原性分析。结果生物信息学分析结果显示,Eg-TSP3基因全长681 bp,编码226个氨基酸,蛋白分子式为C_(1113)H_(1772)N_(270)O_(297)S_(20),无信号肽,有4个跨膜区,理论相对分子质量约24×10^(3),含有5个B细胞抗原表位,为稳定的胞内蛋白。Eg-TSP3的氨基酸序列与绦虫属的氨基酸序列一致性为90%以上,进化关系中两者亲缘性极近,与人的氨基酸序列一致性为42.2%,进化关系中两者亲缘性较远。TSP3基因在细粒棘球绦虫的原头蚴、包囊壁以及成虫阶段均有转录,且转录水平无显著差异。双酶切鉴定及测序分析,证明成功构建重组质粒pET32a-TSP3,重组质粒转化BL21后成功诱导表达蛋白,Western blot结果显示,该蛋白具有良好的反应原性。结论本研究初步表明Eg-TSP3蛋白是一个具有潜在研究价值的疫苗免疫靶点,为进一步研究囊型包虫病的疫苗候选分子奠定了基础。