缺氧微环境对TSST-1诱导的抗CEA^+结肠癌LoVo细胞免疫治疗的调控

目的:研究缺氧微环境对靶向性表达的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)激活人外周血淋巴细胞(peripheral bloodlymphocyte,PBL)对CEA^+结肠癌LoVo细胞杀伤作用的调控。方法:包装、收集前期构建的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和癌胚抗原启动子CEAp联合调控的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-1inker-CD80TM(简称pLEGFP-N1-5HCTC),感染CEA^+LoVo细胞及CEA^-宫颈癌HeLa细胞,获取稳定表达跨膜型超抗原TSST-1-linker-CD80TM蛋白(TC融合蛋白)的肿瘤细胞。用缺氧模拟试剂CoC1_2模拟缺氧微环境,RT-PCR和WesterRblotting分别检测缺氧调控下TSST-1的表达水平。将健康人PBL与pLEGFP-N1-SHCTC感染后的肿瘤细胞共培养,~3H-TdR掺入法检测缺氧调控下PBL的增殖能力,MTT法检测缺氧调控下PBL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:pLEGFP-N1-5HCTC病毒成功感染CEA^+LoVo细胞(5HCTC/LoVo),RT-PCR和Western blotting证实,缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞中TSST-1mRNA和蛋白的表达,CEA^-HeLa细胞在常氧和缺氧条件下均无TSST-1的表达。缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞诱导的人PBL的增殖(7.3×10~3 vs 3.1×10~3cpm,P<0.05),缺氧环境下PBL对5HCTC/LoVo细胞的杀伤率明显高于常氧环境(82.69%vs53.50%,P<0.01);CEA^-HeLa细胞不能刺激PBL增殖,PBL对其也无抑制作用。结论:缺氧微环境可显著上调靶向性表达的超抗原TSST-1诱导的对CEA^+LoVo细胞的杀伤作用。

TSST-1合成肽之超抗原T细胞表位的Vβ特异性鉴定

对两个含有超抗原Ｔ细胞表位的ＴＳＳＴ－１交叠肽之Ｖβ特异性进行了鉴定。结果显示：两合成肽均具备天然ＴＳＳＴ－１分子四种人和小鼠Ｖβ特异性的两种（人Ｖβ２和小鼠Ｖβ１５）。表明：两合成肽所含有的超抗原Ｔ细胞表位是ＴＳＳＴ－１特异性的；同时，两合成肽Ｖβ特异性的一致性。

TSST-1超抗原的T细胞免疫识别研究

ＴＳＳＴ┐１超抗原的Ｔ细胞免疫识别研究博士生论文摘要ＳｔｕｄｙｏｎｉｍｍｕｎｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎＴＳＳＴ┐１ｂｙＴｃｅｌｓ胡伟钢朱锡华（第三军医大学基础部免疫学教研室）重庆，６３００３８超抗原是一类受到高度重视的新型...

姜黄素抑制超抗原TSST-1诱导脾细胞炎症因子的作用

目的观察姜黄素对毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)诱导的小鼠脾细胞炎症因子的影响,为进一步探讨姜黄素对炎症性休克的作用提供依据。方法采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测不同剂量的TSST-1和姜黄素的细胞毒作用,ELISA和流式细胞术检测相关炎症因子。结果所选剂量TSST-1和姜黄素均未发现有明显细胞毒作用。TSST-1诱导脾细胞产生了大量的IFN-γ和IL-2,产生了少量的TNF-α,未能诱导出IL-1β、IL-6和IL-12。TSST-1诱导的Th1细胞因子产生不完全依赖于IL-12。姜黄素对IFN-γ和TNF-α的抑制作用与剂量有关,在15μmol/L抑制效果最显著(P<0.05),但对IL-2无显著抑制作用(P>0.05)。结论姜黄素能显著降低TSST-1诱导小鼠脾细胞产生的IFN-γ和TNF-α,但对T细胞增殖无明显抑制作用。

ANALYSIS OF MOTIF IN TCR Vβ HV4 SEQUENCES BINDING SUPERANTIGEN TSST-1

首先对４１种人和小鼠的Ｔ细胞受体β链可变基因编码肽段（Ｖβ）的氨基酸序列进行多序列对准，就Ｖβ之第四高变区（ＨＶ４）片段进行比较，分析与超抗原毒素休克综合征毒素－１（ＴＳＳＴ－１）结合的四种Ｖβ（小鼠Ｖβ３、Ｖβ１５、Ｖβ１７和人Ｖβ２）之ＨＶ４序列内是否存在特定的氨基酸残基排列模式。结果发现：小鼠Ｖβ３和Ｖβ１７的ＨＶ４具有特异的ＲＦＳＡＸＣＸＳＮＳ模式，而小鼠Ｖβ１５和人Ｖβ２的ＨＶ４则含独特的ＫＦＸＩＸＨ模式。提示：与ＴＳＳＴ－１结合的四种Ｖβ所对应的Ｔ细胞识别表位可能不止一个。

超抗原TSST-1之靶TCRVβHV4序列的特征分析

首先对人和小鼠的TCRVβ的氨基酸序列进行多序列对准,就Vβ之HV4片段进行比较,分析与超抗原TSST-1结合的四种Vβ（小鼠Vβ3、Vβ15、Vβ17和人Vβ2）之HV4序列内是否存在特定的氨基酸残基排列主型。结果发现:小鼠Vβ3和Vβ17的HV4具有特异的RFSAXCXSNS主型,而小鼠Vβ15和人β2的HV4则含独特的KFXIXH主型。提示:与TSST-1结合的四种Vβ所对应的T细胞识别表位可能不止一个。

用PCR与ELISA、RPLA对照检测乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1

用PCR方法对14个奶牛场分离得到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌(金葡菌)124株,隐性乳腺炎金葡菌213株,山羊临床型乳腺炎金葡菌12株进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.see和tst基因的分子调查,结果表明:奶牛标本肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎为1.41%,山羊标本为33.3%。奶牛标本产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,山羊标本产生肠毒素的类型以SEC为主。对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金葡菌同时用ELISA和RPLA检测,3种方法检测结果基本一致。

超抗原TSST－1的T细胞表位预测

本文采用可及性和可塑性方案对超抗原ＴＳＳＴ－１的Ｔ细胞表位进行预测，结果显示：Ｔ细胞表位可能位于残基６５～７８、９０～９５、１０８～１１２、１４４～１５２和１５８～１８０或它们附近。它们的二级结构均含无规则卷曲。在这些预测的Ｔ细胞表位中，有一个与文献报道的ＴＳＳＴ－１之Ｔ细胞表位基本相符，还有一个含有数个已确定的ＴＳＳＴ－１超抗原之必需氨基酸残基。本研究为用合成肽对ＴＳＳＴ－１Ｔ细胞表位的研究提供了线索。

乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1的调查研究

目的用PCR方法对14个奶牛场分离得到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌(金葡菌)124株,隐性乳腺炎金葡菌213株,山羊临床型乳腺炎金葡菌12株进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.see和tst基因的分子调查,结果表明:奶牛标本肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎为1.41%,山羊标本为33.3%。奶牛标本产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,山羊标本产生肠毒素的类型以SEC为主。对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金葡菌同时用ELISA和RPLA检测,3种方法检测结果基本一致。

中毒休克综合征毒素-1在小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎中的作用

为探究金黄色葡萄球菌(S.aureus)超抗原毒素在其产生菌引起的乳腺炎中的作用,本研究纯化制备了重组中毒休克综合征毒素1(rTSST-1),并以5μg、15μg和30μg 3个剂量接种小鼠乳腺,结果显示3个剂量均引起了小鼠乳腺眼观炎症变化,并随着感染剂量加大病变呈现加重趋势。以1×10~2cfu和1×10~3cfu两个剂量的S.aureus R8菌株感染乳腺后24h眼观均出现了红肿变化,48h、72h时出现了化脓、干酪样坏死,且高剂量组病变重于低剂量组。进一步比较研究了以rTSST-1(15μg)、S.aureus R8(1×102cfu)和rTSST-1(15μg)+S.aureus R8(1×102cfu)等接种小鼠乳腺后对乳腺的影响,结果显示rTSST-1组小鼠乳腺眼观病变最轻,S.aureus R8组最重;接种24h后观察组织病变,结果显示rTSST-1组与rTSST-1+S.aureus R8组病变相近,小鼠乳腺腺泡形态边缘不完整、腺泡内有大量嗜中性粒细胞浸润。然而S.aureus R8组小鼠乳泡形态边缘破坏严重但嗜中性粒细胞等免疫细胞浸润数量明显少于前两组。乳腺活菌计数结果显示,S.aureus R8组小鼠的活菌数显著高于rTSST-1+S.aureus R8组。本研究结果显示TSST-1可单独引起小鼠乳腺炎症,而在TSST-1与S.aureus同时感染乳腺时,TSST-1减轻了乳腺组织的炎症程度。这一结果显示TSST-1引起的小鼠腺泡中嗜中性粒细胞的大量浸润可能对促进乳腺中S.aureus的有效清除具有重要作用。本研究将为有效防控S.aureus引起的奶牛乳腺炎提供新的参考依据。

金黄色葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1 PCR检测方法的建立与初步应用

试验旨在建立敏感、特异快速检测金黄色葡萄球菌超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)的PCR方法。根据TSST-1毒素基因(tst基因)的序列,设计合成了特异性引物,优化了PCR方法的引物浓度、退火温度及DNA模板量,测定了方法的灵敏度与特异性,并应用所建立的PCR方法检测了67株金黄色葡萄球菌分离株中的tst基因。结果表明,建立的PCR方法的最佳退火温度为55℃、引物浓度为0.4μmol/L,检测灵敏度为20 pg DNA,与表皮葡萄球菌、猪链球菌、四联球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等均不发生交叉反应。在67株金黄色葡萄球菌分离株中,13株携带tst基因,其中鸡源分离株中携带tst基因的菌株约占9.1%(1/11),牛源分离株中携带tst基因的菌株约占21.4%(12/56)。本研究建立的PCR方法能够快速、特异、敏感地检测金黄色葡萄球菌超抗原TSST-1毒素基因,为动物源性食品中TSST-1的检测及产TSST-1毒素菌株的流行病学调查提供重要技术支持。

金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的相关性研究

目的研究携带TSST-1和PVL基因的金黄色葡萄球菌耐药特点、分布特征及与致病性的关系。方法临床收集74株金黄色葡萄球菌,采用PCR法检测TSST-1、PVL和mecA基因,纸片扩散法进行17种抗菌剂的耐药性检测。结果 74株金黄色葡萄球菌中mecA基因检出率为55.4%,其中22株检出PVL基因(30.3%),PVL阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为15株(36.6%),甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)为7株(21.2%),两者间差异无统计学意义(P>0.05)。5株金黄色葡萄球菌中检出TSST-1基因(6.3%),均为MRSA。MRSA耐药性严重,并呈多重耐药性,携带基因PVL和TSST-1的MRSA除对万古霉素敏感外,对其他抗菌剂均耐药。结论携带基因TSST-1和PVL的金黄色葡萄球菌耐药性及致病力更强,增加了临床抗感染治疗的难度。

金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素-Ⅰ的研究进展

金黄色葡萄球菌能引起人类各种疾病，其中中毒性休克综合征（toxic shock syndrome，TSS）因多器官受累，病死率高而倍受重视。Todd等于1978年首次介绍了TSS，并报道了7个典型TSS病例，认为此病是由金黄色葡萄球菌引起的。1981年从TSS相关的金黄色葡萄球菌中分离到与发病密切相关的致热外毒素C和肠毒素F，现已明确两者为同一物质，统称为TSST-1，是TSS最主要的致病因子。

T34肽的圆二色性研究

Ｔ３４肽的圆二色性研究＊胡伟钢１朱锡华１吴玉章１贾正才１Ｔ３４肽是对应于超抗原毒素休克综合征毒素－１（ＴＳＳＴ－１）蛋白质分子中的第１２５至第１５８位残基序列合成的，以往的研究证明：Ｔ３４肽内含有一个ＴＳＳＴ－１的超抗原Ｔ细胞表位，此表位的ＴＣＲＶβ...

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌超抗原的检测

用PCR方法对分离到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌124株,隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌213株,进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed,see和tst基因的检测,结果表明:奶牛临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素基因的阳性率为1.41%,奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金黄色葡萄球菌同时用ELISA和RPLA两种方法进行检测,3种检测方法结果基本一致。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性,SCCmec分型及毒素基因的检测

目的调查北京大学第一医院致病性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型情况、耐药状况、PVL、TSST-1基因携带率,初步了解临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药原因,为临床感染控制提供依据。方法收集2007年9月至2008年3月住院患者首次分离的53株有致病意义MRSA,用全自动微生物分析仪进行药敏试验,应用PCR方法检测MRSA的SCCmec基因型、PVLT、SST-1基因。结果53株MRSA呈多重耐药特点,SCCmec分型以ⅢA为主(47.2%),PVL基因均为阴性,12株(22%)MRSA TSST-1阳性。结论53株MRSA的多重耐药性与SCCmec结构密切相关,SCCmec分型技术是探索MRSA多重耐药性与耐药结构有效的分子生物学手段,TSST-1基因阳性株在临床分离的金黄色葡萄球菌中占有较高的比例。

葡萄球菌中毒性休克毒素的分离纯化及其体外抗肝癌活性分析

采用固体膜进行TSST 1的产毒培养,然后从金葡菌产毒产物中经CM纤维素离子交换层析、SephadexG 75、SephacrylS 200三步纯化,成功地获得了纯度为95.3%的毒素,SDS PAGE呈现单一条带,与其对应抗血清有免疫学特异反应,不含核酸、糖和其它肠毒素等物质.与同类方法相比,该方法步骤少、快速、简便.对其体外抗肝癌活性进行了分析,首次证明即使TSST 1的浓度为10-8g L仍然对人肝癌细胞有显著抑制作用.

抗CD28─超抗原活化T细胞的TCRVβ特异性

对ＡＰＣ辅助超抗原活化Ｔ细胞的确切机制迄今仍不十分清楚。近年来有实验报道，在体外缺乏ＡＰＣ的情况下，仅靠ＣＤ２８分子的共刺激超抗原仍可活化Ｔ细胞。本实验对该情况下超抗原ＴＳＳＴ－１活化Ｔ细胞的ＴＣＲＶβ特异性进行鉴定，旨在观察单靠ＣＤ２８分子的共刺激ＴＳＳＴ－１活化Ｔ细胞是否仍保留超抗原所特有的方式。结果显示，ＴＳＳＴ－１在ＣＤ２８分子的共刺激下活化人的Ｔ细胞确是与其在ＡＰＣ辅助下活化人Ｔ细胞的方式一致，即均以ＴＣＲＶβ２特异性的方式。

社区与医院获得性感染金黄色葡萄球菌毒力因子对比分析

目的了解社区与医院获得性感染金黄色葡萄球菌的毒力因子PVL和TSST-1的携带情况。方法收集社区和医院获得性感染金黄色葡萄球菌菌株184株和262株,PCR检测毒力因子基因pvl和tst,统计分析检出率的差异。结果pvl在社区感染菌株中的检出率(11.96%)高于医院感染(0.76%),在MSSA中的检出率(7.50%)高于MRSA(2.91%);与pvl相反,tst在社区感染菌株的检出率(6.52%)低于医院感染(17.56%),在MSSA中的检出率(5.83%)低于MRSA(21.36%)。对不同感染部位菌株pvl和tst检出率进行两两比较后发现,社区皮肤/软组织感染菌株pvl的检出率最高,而医院感染菌血症菌株中tst的检出率最高。结论 PVL和TSST-1作为金黄色葡萄球菌的2种重要毒素,与感染部位、社区/医院获得性、细菌耐药性、疾病的严重性及转归都可能存在密切关系。