芥菜型油菜TT1基因的克隆和SNP分析

拟南芥的TT1基因(编码含有WIP结构域的锌指蛋白)对种皮的发育和颜色的形成具有重要的调控作用。本研究利用同源克隆和RACE技术分离了芥菜型油菜TT1基因,在芥菜型油菜黄黑籽材料的种皮中进行转录水平的分析,比较了黑籽油菜与黄籽油菜基因序列的差异,并采用等位基因特异(allele-specific)PCR技术对可能存在的单核苷酸多态位点进行验证。结果表明,芥菜型油菜TT1基因的DNA序列全长为2197bp,包含1个内含子,与甘蓝型油菜TT1-1基因的DNA序列的相似性为99%,与拟南芥的TT1基因DNA序列的相似性为85%;推导的TT1蛋白序列为300氨基酸残基,理论分子量为33.97kD,等电点为6.99;TT1在所有材料的种皮中均检测到表达;比较紫叶芥、四川黄籽、NILA和NILB的TT1基因序列,共发现8个核苷酸变异位点,均在基因的外显子区域,其中紫叶芥和NILA的序列相同,四川黄籽和黒籽近等基因系NILB的序列相同。与紫叶芥相比,黒籽近等基因系NILB有8个核苷酸差异,但种皮颜色与紫叶芥一样,均为黑色,TT1基因这些位点的突变并不影响芥菜型油菜种皮的颜色。通过等位特异PCR可以区分来自四川黄籽与紫叶芥的TT1基因。

核桃TT1类转录因子的筛选及干旱响应分析

TT1基因(transparent testa1)在植物逆境响应中有重要作用。核桃是重要的经济树种,其产量和质量均受环境影响。为进一步探索核桃(Juglans regia)抗逆机制,以‘香玲’核桃为试验材料,克隆获得核桃JrTT1基因,并进行基因表达和生物信息学分析,预测该基因的基本生物功能。结果表明,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因的开放阅读框(OFR)分别为1014、1023、1029 bp,蛋白分子量分别为37763.51、38492.94、38136.36 u,含有氨基酸数分别为337、340、342,理论等电点分别为7.88、7.19、8.89。与其他物种的同源TT1蛋白具有较近的进化关系。且其上游1200 bp启动子中含有多种与干旱逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,JrTT1-1、JrTT1-2、JrTT1-3基因在PEG 6000胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在叶和根中的表达趋势不同。表明JrTT1基因可以响应干旱胁迫诱导,并具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中具有一定作用。

甘蓝型油菜TT1基因反义植物表达载体的构建

拟南芥TT1(transparenttesta1)基因编码一个WIP类型锌指蛋白转录因子,调控内种皮发育和原花青素在内种皮的积累。本研究通过PCR扩增了甘蓝型油菜(Brassicanapus)TT1基因家族(BnTT1)的一段特异保守片段TT1A,并将其亚克隆到中间载体pCambia2301G中,构建了TT1反义植物表达载体pCambia2301G-TT1A,通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。此表达载体的构建为进一步研究TT1基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和利用反义TT1基因遗传转化获得转基因新型黄籽油菜奠定了基础。

基于KASP技术开发检测水稻耐高温TT1基因型的分子标记

高温是对水稻产量和品质有重要影响的环境因素之一,随着全球气候逐渐变暖,高温热害对水稻生产构成了严重的威胁。研究发现非洲栽培稻CG14中的OgTT1等位基因可以显著提高水稻耐高温特性。为了更高效利用OgTT1等位基因选育耐高温水稻品种,根据OgTT1等位基因的功能性SNP位点设计了一个高通量分子标记TT1-KASP。利用该分子标记对来源于NIL(CG14)分别与申恢26、申6B杂交的F_4代重组自交系进行检测,检测结果表明在F_4代重组自交系的65个株系中,4个株系不含OgTT1等位基因,53个株系OgTT1等位基因纯合,而其余的8个株系为杂合基因型。对65个F_4代重组自交系株系进行基因测序后发现,得到的基因序列与TT1-KASP标记所得序列完全一致。该结果表明TT1-KASP分子标记可以用于耐高温水稻新品种的标记辅助选择育种工作。

水稻耐高温TT1基因的功能标记的开发与应用

高温是影响水稻的产量和品质的重要环境因素之一。26S蛋白酶体能消除细胞毒性变性蛋白,是水稻应对高温热激的一个重要机制。水稻TT1基因编码26S蛋白酶体的α亚基,非洲栽培稻和亚洲栽培稻TT1等位基因中的一个SNP位点造成精氨酸到组氨酸(R99→H99)的改变,使得非洲栽培稻具有更强的耐高温性。本研究根据TT1基因功能性SNP位点设计dCAPS标记TT1-P2。利用TT1-P2标记对申9B、NIL(CG14),及其杂交F1代的TT1基因型鉴定,结果TT1-P2标记鉴定的基因型与测序的结果一致。用TT1-P2标记对杂交F2代群体的TT1基因型鉴定,发现TT1WYJ、杂合型和TT1CG14这3种基因型符合1∶2∶1的分离比。这些结果表明TT1-P2能准确的鉴别TT1的基因型,可用于耐高温水稻品种的分子标记辅助育种。

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。

转基因水稻TT51—1标准物质的研制

将筛选后的转基因水稻qT51—1和非转基因水稻明恢63种子分别冷冻研磨成粉末，采用重量法配置了5个不同水平的标准物质。经检验该标准物质的均匀性良好，可在4℃保存条件下存储1年。标准物质采用重量法的质量分数作为标准值，数字PCR测定拷贝数分数作为参考值，通过转基因水稻与非转基因水稻种子粉末提取效率比值校准的数字PCR定值结果与重量法质量分数定值结果之间具有等效一致性，该标准物质可用于转基因水稻TT51—1的定量PCR检测及其特异性检测方法的评价。

转基因大米TT51-1品系精准定量检测方法的比较研究

基于大米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因和TT51-1品系特异性基因序列筛选适用于数字PCR的内、外源基因特异性引物探针并建立转基因大米TT51-1品系的双重数字PCR定量方法。其定量的绝对灵敏度和相对灵敏度分别达2 copies/μL和0.1%。当样品中TT51-1转基因大米成分含量低至0.1%时,6次定量值的相对标准偏差在7.30%~18.63%之间,偏差在-8.77%~9.62%之间,精密度和稳定性均较为理想,而同样的引物探针所建立的实时荧光PCR方法定量的相对灵敏度仅达到1%。为促进该方法的标准化应用,将微滴式数字PCR平台上建立的定量方法在芯片式数字PCR平台上进行室内验证,结果表明该方法的定量精密度和准确性符合要求。该方法可应用于大米、稻谷及其初加工产品中TT51-1转基因大米成分的精准定量检测。

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

基于TT51-1水稻种子标准曲线检测的可靠性分析

为了分析在同一个实验室的2台不同型号的实时荧光定量PCR仪(扩增曲线和标准曲线的相关参数)可比性,在常规条件下,使用同一批号的试剂,将标准品及同一水稻种子样品TT51-1在2台荧光定量PCR仪上进行扩增,对标准曲线的参数及分析结果进行比对,分析其一致性。结果表明,作为单一的检测系统,运用同一批号试剂对相同标准品及待检样品的试验中,2台实时荧光定量PCR仪测定的结果差异没有统计学意义(P>0.05)。通过对标准曲线的相关参数和待检测样品的检测结果的分析,可以判定实验室存在的2台实时荧光定量PCR仪检测的结果的一致性,可确保检测结果可靠。

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.

浅谈Kelvin四线测试技术以及在ATE测试中的应用

介绍了开尔文(Kelvin)四线连接方式的原理及Kelvin连接在ATE(Automated Test Equipment,自动测试设备)测试中的应用,通过列举STS8200测试系统应用Kelvin四线连接方式的例子,说明Kelvin连接方式在ATE测试系统中的重要性。

旅行新玩意

3月，春天的气息顽强地钻透了冬日的铁壁，让我们带上几件合意的新装备踏上寻春之旅吧。