甘蓝型油菜透明种皮12(TT12)基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。

芸薹属原花青素跨膜转运蛋白TT12、AHA10基因家族RNA干扰载体的构建

拟南芥TT12和AHA10基因分别编码MATE类型和H+泵类型的跨膜转运蛋白,介导原花青素单体向液泡的转运,对种皮色素的积累起重要作用。甘蓝型油菜是重要的油料作物,但缺乏黄籽基因型,现有黄籽材料表型不稳定,黄籽性状的分子机理不清,缺乏相关的分子育种。克隆了芸薹属TT12和AHA10基因家族的RNA干扰载体片段BTT12I和BA-HA10I,以基于pFGC5941而改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架,构建了相应的RNAi载体pFGC5941M-BTT12I(简称pBTT12I)和pFGC5941M-BAHA10I(简称pBAHA10I),通过分子鉴定后转化农杆菌,获得工程菌株,有利于通过基因沉默技术研究TT12和AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用和机理,探索黄籽性状的分子育种。

黑莓(Rubus spp.)TT12基因的同源克隆及其生物学信息分析

从长势良好‘阿拉好’黑莓(Rubus spp.)的果实中提取并分离总RNA,反转录成c DNA,根据已登录的黑莓转录组数据,参考其它植物透明外种皮基因(TRANSPARENT TESTA 12,TT12)设计引物,通过RT-PCR扩增得到目的条带,命名为Ru TT12-1。序列分析发现:Ru TT12-1基因全长1 659 bp,具有一个1 464 bp的开放阅读框,编码486个氨基酸,蛋白质分子量为53.09 k D,等电点为5.416。同源性分析表明,其核苷酸序列与其它植物TT12同源基因的一致性为71%~89%。实验分析表明,Ru TT12-1蛋白含有两个MATE结构域,说明此基因属于MATE家族;亚细胞定位预测显示,此基因定位于细胞质膜。蛋白二级结构预测显示,Ru TT12-1蛋白有15个α-螺旋,19个β折叠区,21个β-转角,其大多数氨基酸为具有疏水性。本研究初步了解了该基因的生物学信息特征,有助于今后进一步了解其相关功能,进而揭示花青素苷和原花青素由细胞质转移到细胞中央大液泡的转运过程。